一種基于水解過程的多糖快速鑒別方法

馬耀宏，孟慶軍，楊艷，楊俊慧，史建國，張利群，鄭嵐，劉偉霞

(1.山東省科學(xué)院生物研究所，山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250014;2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東泰安271018;3.山東省計(jì)算中心，山東濟(jì)南250014)

糖類是生物體內(nèi)除蛋白質(zhì)和核酸以外的又一類重要的物質(zhì)，蘊(yùn)涵十分豐富的生物學(xué)信息，是細(xì)胞識(shí)別和信息遺傳等重要生物學(xué)功能的參與者，近年來已成為生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)［1－2］。

多糖，尤其是水溶性多糖，由于在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化和降血糖等方面具有獨(dú)特的生理活性與功能［3－4］，相關(guān)研究進(jìn)展迅速。隨著該研究領(lǐng)域儀器分析手段的不斷進(jìn)步，有關(guān)多糖結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究備受關(guān)注［5－6］。目前對(duì)多糖結(jié)構(gòu)功能研究常用的大型儀器分析技術(shù)有氣質(zhì)聯(lián)用、紫外及紅外光譜分析、核磁共振、高效液相、X射線晶體掃描以及原子力顯微技術(shù)等［7－8］。但是，由于多糖結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的復(fù)雜性，使得單一儀器分析手段具有一定的局限性。氣相色譜法測(cè)定糖類所遇到的主要困難是糖類本身沒有足夠的揮發(fā)性，必須將其轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性衍生物才能進(jìn)行測(cè)定。高效液相色譜法由于使用通用的示差折光檢測(cè)器靈敏度低而受到限制;若使用紫外或熒光檢測(cè)器來提高分析靈敏度，糖類化合物須先經(jīng)過標(biāo)記衍生，操作繁雜;并且衍生反應(yīng)的發(fā)生總伴隨樣品的損失，這對(duì)目前分析要求的日益提高不利。傳統(tǒng)的電泳法及20世紀(jì)80年代后期迅速發(fā)展起來的高效毛細(xì)管電泳法能進(jìn)行糖的分離檢測(cè)，但重復(fù)性相對(duì)較差，該技術(shù)的穩(wěn)定性能達(dá)不到實(shí)際需求。核磁共振技術(shù)解決了糖苷鍵構(gòu)型問題，但難以分辨非異頭質(zhì)子的位移，解析方法十分繁雜。通常要弄清楚一個(gè)多糖的結(jié)構(gòu)往往需要數(shù)種大型儀器與化學(xué)分析方法結(jié)合，同時(shí)花費(fèi)專業(yè)研究人員幾個(gè)月甚至整年的時(shí)間與精力。這些實(shí)驗(yàn)方法由于測(cè)試周期長，根本無法在生產(chǎn)過程中使用。多糖的快速分析與鑒別是多糖研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題。本文研究了水溶性多糖水解過程中還原糖(還原性末端數(shù))和葡萄糖的水解過程變化規(guī)律，通過分析水解過程圖譜，實(shí)現(xiàn)了對(duì)樹舌、靈芝和蟲草多糖的快速鑒別，目前國內(nèi)外未見相關(guān)研究報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

HH-S型恒溫水浴鍋，上海羌強(qiáng)儀器設(shè)備有限公司;JPI-5型架盤天平，蘇州博泰偉業(yè)電子科技有限公司;YH-1型電子萬用爐，金壇市諾藝實(shí)驗(yàn)儀器廠;SBA-40D型生物傳感分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所;SGD-IV-D型全自動(dòng)還原糖測(cè)定儀，山東省科學(xué)院生物中心;81-2型磁力恒溫?cái)嚢杵鳎虾Ｋ紭纷詣?dòng)化科技有限公司;DS-1型高速組織搗碎機(jī)，上海滿賢經(jīng)貿(mào)有限公司;20RP-52D型自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)，內(nèi)蒙古農(nóng)大動(dòng)物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院;A-2電熱鼓風(fēng)干燥箱，福建省泉州宇博電子廠。

1.1.2 試劑

0.15 mol/L鹽酸的配制:用移液管取37% 濃鹽酸6.25 mL，用蒸餾水定容至1 000 mL。

0.10 mol/L氫氧化鈉溶液的配制:稱量氫氧化鈉4.0 g，加入到盛有適量蒸餾水的燒杯中，用蒸餾水定容至1 000 mL。

1.00 g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置:精密稱量烘干后的無水葡萄糖1.000 0 g，用蒸餾水定容至1 000 mL。

1.2 方法［9－10］

1.2.1 胞外粗多糖的制備

分別取培養(yǎng)成熟的樹舌、靈芝和蟲草發(fā)酵液，以發(fā)酵液中殘留還原糖低于0.01%為基準(zhǔn)，用5 000 r/min離心機(jī)離心15 min，并用0.2 μm過濾器過濾，獲得上清液。上清液加入1.5～3倍無水乙醇沉淀多糖30 min。醇沉液體用10 000 r/min，離心15 min，棄上清液。沉淀置于60℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干24 h，獲得胞外粗多糖樣品。

1.2.2 胞內(nèi)多糖的制備

蟲草發(fā)酵液經(jīng)離心后的菌絲體沉淀，用蒸餾水沖洗3～4次，菌絲體中加入適量5% 氯化鈉溶液，放入組織搗碎機(jī)中，高速搗碎30 min。搗碎的菌絲體液，用超聲波進(jìn)行細(xì)胞破碎。破碎菌絲體溶液100℃煮沸2 h。溶液冷卻后，用高速離心機(jī)10 000 r/min離心10 min，取上清液，加入1.5倍體積的無水乙醇，靜置過夜，10 000 r/min離心10 min，取沉淀，于60℃烘箱中烘干，即得蟲草胞內(nèi)粗多糖樣品。

1.2.3 多糖的酸水解方法

精密稱取0.300 0 g多糖樣品，于100 mL小三角瓶中，加入30.0 mL蒸餾水充分溶解，再加入30.0 mL 0.15 mol/L鹽酸，混勻，沸水浴5 h。水解前半個(gè)小時(shí)每隔5 min，以后每隔10 min取0.50 mL的水解液，將水解液迅速冷卻并加入0.30 mL濃度為0.10 mol/L的氫氧化鈉溶液終止水解反應(yīng)，后微調(diào)水解液pH值至7.0，獲得該樣品的不同水解時(shí)間的水解液測(cè)試樣品。

1.2.4 水解過程參數(shù)的測(cè)定方法

還原糖含量使用SGD-IV-D型全自動(dòng)還原糖測(cè)定儀測(cè)定，每次取樣量0.5 mL;葡萄糖含量采用SBA-40D型葡萄糖酶電極法，每次取樣量20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹舌多糖水解過程圖譜

平行測(cè)定兩次樹舌多糖水解過程中葡萄糖、還原糖的含量變化。稱取樹舌粗多糖0.299 8 g，按1.2.3和1.2.4的測(cè)定方法，測(cè)定結(jié)果見圖1;平行測(cè)定稱取樹舌粗多糖0.300 3 g，按同樣方法測(cè)定，結(jié)果見圖2。

圖1 樹舌多糖水解過程圖譜Fig.1 Hydrolysis process map of Ganoderma applanatum Pat polysaccharides

圖2 平行測(cè)定樹舌多糖水解過程圖譜Fig.2 Paralleldetermination hydrolysis processmap of Ganoderma applanatum Pat polysaccharides

由圖1圖譜可知，多糖水解過程中葡萄糖和還原糖含量隨時(shí)間逐步增加。葡萄糖含量在糖水解過程中占還原性糖的比例由起始時(shí)的75%左右逐漸降低至65%左右;由圖2圖譜可見同樣的結(jié)果。圖1～2顯示葡萄糖和還原糖在時(shí)間進(jìn)程上數(shù)值穩(wěn)定，葡萄糖占還原糖比值穩(wěn)定。由圖1和圖2比對(duì)可以看出，同一種樹舌多糖樣品水解圖譜是穩(wěn)定的，圖形相似。

2.2 靈芝多糖水解過程圖譜

平行測(cè)定兩次靈芝多糖水解過程中葡萄糖、還原糖的含量變化。稱取靈芝粗多糖0.300 3 g，按1.2.3和1.2.4的測(cè)定方法，結(jié)果見圖3;平行測(cè)定稱取靈芝粗多糖0.300 2 g，按同樣的測(cè)定方法，結(jié)果見圖4。

由圖3可知，靈芝多糖水解過程中葡萄糖和還原糖含量隨時(shí)間逐步增加。葡萄糖含量在靈芝多糖水解過程中占還原性糖的比例由啟始時(shí)的70%左右逐漸提高為80%左右;由圖4可見同樣的結(jié)果。圖3～4顯示葡萄糖和還原糖在時(shí)間進(jìn)程上數(shù)值穩(wěn)定，葡萄糖占還原糖比值穩(wěn)定。

由圖3～4可知，水解5 h后，該靈芝粗多糖水解液中葡萄糖占還原糖的比例分別為80%、78%。圖3和圖4的比對(duì)分析顯示，同一種靈芝多糖樣品水解圖譜是穩(wěn)定的。

2.3 蟲草胞內(nèi)多糖水解過程圖譜

稱取蟲草胞內(nèi)粗多糖0.300 3 g，按1.2.3和1.2.4水解過程參數(shù)的測(cè)定方法，結(jié)果見圖5，平行測(cè)定稱取蟲草胞內(nèi)粗多糖0.300 5 g，按同樣的方法測(cè)定，結(jié)果見圖6。

由圖5～6可知，蟲草胞內(nèi)多糖在該水解條件下水解液中幾乎不含葡萄糖，多糖水解過程中還原糖含量隨時(shí)間逐步增加。圖譜1～2顯示葡萄糖和還原糖在時(shí)間進(jìn)程上數(shù)值穩(wěn)定，還原糖水解速率幾乎相同。還可以看出，同一種蟲草胞內(nèi)多糖樣品水解圖譜是穩(wěn)定的。

圖3 靈芝多糖水解過程圖譜Fig.3 Hydrolysis process map ofGanoderma lucidum polysaccharides

圖4 平行測(cè)定靈芝多糖水解過程圖譜Fig.4 Paralleldetermination hydrolysis processmap of Ganoderma lucidum polysaccharides

圖5 蟲草胞內(nèi)多糖水解過程圖譜Fig.5 Hydrolysis process map of Cordyceps polysaccharides

圖6 平行測(cè)定蟲草胞內(nèi)多糖水解過程圖譜Fig.6 Paralleldetermination hydrolysis processmap of Cordyceps polysaccharides

3 結(jié)論

(1)在精密控制多糖水解的條件下，同一種樹舌、靈芝和蟲草胞內(nèi)多糖的水解圖譜是穩(wěn)定且可以重復(fù)的。

(2)通過比較樹舌、靈芝和蟲草胞內(nèi)多糖的水解圖譜，發(fā)現(xiàn)它們之間的區(qū)別非常明顯。每一種多糖的水解圖譜具有各自的特征，同種多糖水解過程參數(shù)測(cè)定數(shù)值穩(wěn)定，且參數(shù)之間對(duì)應(yīng)關(guān)系穩(wěn)定。比對(duì)不同多糖水解過程中葡萄糖、還原糖含量的水解圖譜，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同來源的多糖的快速鑒別分析。

(3)如果建立更多的單糖快速分析傳感器，如半乳糖、木糖以及甘露糖等，用來記錄標(biāo)準(zhǔn)水解條件的多糖的水解過程，建立多糖水解過程圖譜庫，開發(fā)比對(duì)分析軟件，就能夠根據(jù)水解過程圖譜來實(shí)現(xiàn)對(duì)多糖的快速分析，同時(shí)獲得該多糖的更多信息。如果能夠進(jìn)一步從水解過程中分辨到相對(duì)分子量、糖苷鍵、異構(gòu)形式和單糖構(gòu)型等水解信息，就有可能建立基于水解過程的多糖快速分析方法。

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