正交試驗(yàn)優(yōu)選杜仲葉綠原酸的提取工藝

王柏強(qiáng)，劉福，江承平，何效平，曾芝蘭（.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，四川南充637000；2.川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川南充 637000）

杜仲（Eucommia ulmoidesOliv.）是我國特有的名貴中藥材，傳統(tǒng)用藥以皮為主，但剝皮后樹體容易死亡?，F(xiàn)代研究表明，杜仲葉與皮所含化學(xué)成分基本相同[1]，且葉中部分有效成分比皮還要高[2]。杜仲葉具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的作用，用于治療肝腎不足、頭暈?zāi)垦?、腰膝酸痛、筋骨痿軟等證[3]。本研究在眾多理論基礎(chǔ)上，采用超聲聯(lián)合纖維素酶法提取杜仲葉綠原酸，通過正交試驗(yàn)確定最優(yōu)提取工藝。因杜仲葉中的有效成分主要存在于細(xì)胞壁包被的葉細(xì)胞內(nèi)[4]，故首先用纖維素酶水解杜仲葉細(xì)胞壁，再聯(lián)合超聲輔助提取法對(duì)杜仲葉綠原酸進(jìn)行高效提取，最大限度地利用杜仲葉資源，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

10 A型高效液相色譜儀，包括SPD-10A型紫外檢測器（日本島津公司）；SHZ-DⅢ型循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）；PHS-SB型pH計(jì)（成都瑞馳分析控制儀器有限公司）；760型CRT雙光束紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；TP-114型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；SB-25-12DT型超聲波提取器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 藥材

杜仲葉，購自重慶醫(yī)藥公司，經(jīng)川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院李生茂講師鑒定為真品。

1.3 試劑

纖維素酶（上海伯奧生物科技有限公司，活性：≥15 U/mg）；綠原酸對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：0753-200111）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 綠原酸含量的測定

2.1.1 色譜條件色譜柱：Hypersic C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.4%磷酸溶液（13∶87，V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：327 nm；柱溫：室溫。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒質(zhì)量的綠原酸對(duì)照品13 mg，置100 ml量瓶中以50%甲醇溶解并定容至刻度，即得0.13 mg/ml對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取杜仲葉粉末10 g，加入pH4 NaAc-HAc緩沖液120 ml、纖維素酶20 mg，置40℃水浴中酶解30 min后再于50℃超聲提取30 min，濾過，精密吸取濾液0.5 ml，置10 ml量瓶中，以50%甲醇稀釋并定容至刻度，0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對(duì)照品溶液1、3、5、8、10 ml，置10 ml量瓶中，以50%甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。以峰面積值積分值（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣質(zhì)量濃度（c）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝31 860c+27 633（r＝0.999 9，n＝5）。結(jié)果表明，綠原酸質(zhì)量濃度在1.3～130μg/ml范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.2 不同提取方法比較[5-8]

準(zhǔn)確稱取杜仲葉粉末10 g，采用不同溶劑、不同提取方法進(jìn)行考察。采用乙醇超聲提取法和超聲纖維素酶法所得的綠原酸提取率相對(duì)較高，但乙醇超聲提取需要有機(jī)溶劑，生產(chǎn)成本高；而采用超聲纖維素酶法提取，更節(jié)省能源，更適合工業(yè)化生產(chǎn)。不同提取方法比較結(jié)果見表1。

表1 不同提取方法比較（n＝3）Tab 1 Comparison of different extraction methods（n＝3）

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 酶解pH考察 適當(dāng)?shù)膒H可維持酶活性中心最佳構(gòu)象，促進(jìn)酶與底物結(jié)合；pH不同會(huì)導(dǎo)致酶與作用底物所帶電荷不同，使得酶與底物的親和力不同，從而催化速度也不同。由考察結(jié)果可知，在pH＝4.5時(shí)，綠原酸提取率最高，隨著pH再升高，綠原酸的提取率逐漸下降。酶解pH對(duì)綠原酸提取率的影響見圖1。

圖1 酶解pH對(duì)綠原酸提取率的影響（n＝3）Fig 1 Effects of pH of Enzymatic hydrolysis on the yield of chlorogenic acid（n＝3）

2.3.2 酶解時(shí)間考察 酶解時(shí)間與酶促反應(yīng)進(jìn)行程度密切相關(guān)，反應(yīng)時(shí)間太短，酶解不充分。在考察范圍內(nèi)隨著酶解時(shí)間的增加，綠原酸的提取率呈逐漸增加的趨勢。當(dāng)綠原酸提取率達(dá)到一定值后，酶促反應(yīng)時(shí)間的延長并不能明顯增加提取率。為節(jié)省時(shí)間，選擇酶解時(shí)間為60 min。酶解時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響見圖2。

2.3.3 酶解溫度考察 隨著酶解溫度升高綠原酸提取率逐漸增大，達(dá)到40℃后繼續(xù)升高溫度，綠原酸提取率反而呈現(xiàn)不同程度的下降。主要原因是酶促反應(yīng)中，合適的溫度能使酶保持最大活性，同時(shí)也有利于提取介質(zhì)擴(kuò)散；溫度過高，不僅導(dǎo)致綠原酸氧化分解，也會(huì)使酶蛋白變性。所以，提取溫度在30～50℃之間較為適宜。酶解溫度對(duì)綠原酸提取率的影響見圖3。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響（n＝3）Fig 2 Effects of time of Enzymatic hydrolysis of pH on the yield of chlorogenic acid（n＝3）

圖3 酶解溫度對(duì)綠原酸提取率的影響（n＝3）Fig 3 Effects of temperature of Enzymatic hydrolysis on the yield of chlorogenic acid（n＝3）

2.3.4 酶用量考察 隨著纖維素酶用量的增加，綠原酸提取率明顯增加，當(dāng)酶的用量增加到20 mg時(shí)，酶分子逐漸趨于飽和，提取液中綠原酸的含量增加速度變慢。酶用量對(duì)綠原酸提取率的影響見圖4。

圖4 酶用量對(duì)綠原酸提取率的影響（n＝3）Fig 4 Effects of consumption of Enzymatic hydrolysis on the yield of chlorogenic acid（n＝3）

2.3.5 固液比考察 固液比過小時(shí)，溶液黏度大、濾過困難；在固液比為1∶15（g/ml）時(shí)，綠原酸提取率最大，而固液比過大，導(dǎo)致體系中酶的濃度降低，影響綠原酸提取效果，同時(shí)濾過費(fèi)時(shí)，還會(huì)給后續(xù)純化工藝帶來困難。固液比對(duì)綠原酸提取率的影響見圖5。

圖5 固液比對(duì)綠原酸提取率的影響（n＝3）Fig 5 Effects of the ratio of solid to liquid on the yield of chlorogenic acid（n＝3）

2.3.6 超聲提取時(shí)間考察 超聲提取初期，綠原酸提取率隨著超聲時(shí)間的延長而逐漸升高，至超聲處理40 min時(shí)，綠原酸提取率達(dá)最大值，而后綠原酸含量隨時(shí)間的延長逐漸降低。超聲提取時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響見圖6。

圖6 超聲提取時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響（n＝3）Fig 6 Effects of dosage of ultrasonic time on the yield of chlorogenic acid（n＝3）

2.3.7 超聲提取溫度考察 超聲提取溫度對(duì)綠原酸提取率影響也較大，隨溫度的升高，綠原酸提取率呈增加趨勢，同時(shí)雜質(zhì)溶出量也相應(yīng)增大，溫度過高活性成分易被破壞。為了避免長時(shí)間高溫下綠原酸被氧化分解，以及提高提取操作效率，超聲提取溫度在50℃左右較為適宜。超聲提取溫度對(duì)綠原酸提取率的影響見圖7。

圖7 超聲提取溫度對(duì)綠原酸提取率的影響（n＝3）Fig 7 Effects of dosage of ultrasonic extraction temperature on the yield of chlorogenic acid（n＝3）

2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝

在單因素考察基礎(chǔ)上，以超聲提取時(shí)間（A）、固液比（B）、酶解溫度（C）、酶用量（D）為考察因素，綠原酸提取率為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)。因素與水平見表2；正交試驗(yàn)結(jié)果見表3；方差分析結(jié)果見表4。

表2 因素與水平Tab 2 Factors and levels

由表3、表4可以看出，4個(gè)因素對(duì)綠原酸提取率的影響趨勢與單因素考察結(jié)果基本一致，因素影響的大小為固液比＞超聲提取時(shí)間＞酶解溫度＞酶用量。在考察范圍內(nèi)，就綠原酸提取率而言，固液比與超聲提取時(shí)間為顯著性影響。根據(jù)正交試驗(yàn)和方差分析結(jié)果確定最佳工藝條件為A2B2C3D2，即超聲提取時(shí)間40 min，固液比1∶15（g/ml），酶解溫度45 ℃，酶用量20 mg。

2.5 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

為考察最佳工藝條件的重現(xiàn)性，按最佳工藝條件重復(fù)試驗(yàn)6次。結(jié)果，綠原酸的平均提取率為2.37%，RSD＝2.8%（n＝6），說明優(yōu)選的工藝合理、可行，重現(xiàn)性較好。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Results of orthogonal test

表4 方差分析結(jié)果Tab 4 Results of variance analysis

3 討論

筆者對(duì)不同提取方法與不同提取溶劑進(jìn)行初步考察發(fā)現(xiàn)，以乙醇超聲提取法和超聲纖維素酶法中綠原酸提取率相對(duì)較高。乙醇回流提取雜質(zhì)多[5]，不易濾過，且溫度高，加熱時(shí)間長，易使綠原酸氧化分解。水回流提取法的不足之處在于提取溫度比醇提法更高，濾過分離困難，綠原酸含量也比醇提法偏低。超聲纖維素酶法與乙醇超聲提取法比較，更節(jié)省能源，更適合工業(yè)化生產(chǎn)。

超聲纖維素酶法提取可從多方面促進(jìn)綠原酸的提取，首先運(yùn)用纖維素酶破壞細(xì)胞壁中的纖維素[9]，以加快杜仲葉有效成分的釋放，利于提取分離。其次，利用超聲波的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)及熱效應(yīng)，通過增大介質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)速度，可增大介質(zhì)的穿透力以提取中藥有效成分。綜上，筆者優(yōu)選的工藝不但可提高綠原酸提取率，更重要的是大大節(jié)約了能源，由于所用的酶安全、廉價(jià)，同時(shí)工藝還具有經(jīng)濟(jì)、環(huán)保等特點(diǎn)，為杜仲葉綠原酸的工業(yè)化提取奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

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