別嘌醇對(duì)2型糖尿病小鼠腎小管間質(zhì)prohibitin表達(dá)與細(xì)胞凋亡的影響

張 濤 遲雁青 李 亞 劉茂東 李 英 (河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院腎內(nèi)科，河北 石家莊 050051)

高尿酸血癥與2型糖尿病(T2DM)關(guān)系密切，早期研究只把高尿酸血癥看作糖尿病(DM)慢性并發(fā)癥的預(yù)告因子。然而近年來(lái)，越來(lái)越多的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)顯示，高尿酸已成為DM發(fā)生蛋白尿乃至糖尿病腎病(DN)慢性進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素〔1〕。本實(shí)驗(yàn)選擇T2DM小鼠模型作為研究對(duì)象，應(yīng)用別嘌醇進(jìn)行干預(yù)后觀察抑制尿酸生成對(duì)腎小管間質(zhì)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，并探討其可能的細(xì)胞分子學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 兔抗腎皮質(zhì)抗增殖因子(Prohibitin)、凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)proterntech公司;免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中衫金橋生物有限公司;腎組織勻漿丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程有限公司;TUNEL試劑盒購(gòu)自美國(guó)promage公司;別嘌醇購(gòu)自廣東彼迪藥業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 4～6周齡雄性SPF級(jí)肥胖性T2DM病動(dòng)物模型C57BL/Ksj db/db小鼠12只和對(duì)照C57BL/Ksj db/m小鼠6只購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所。適應(yīng)性喂養(yǎng)2 w后將db/db小鼠隨機(jī)分為2組:db/db小鼠對(duì)照組(db/db組)、db/db小鼠+別嘌醇50 mg·kg-1·d-1治療組 (db/db+A組)。db/m小鼠作為正常對(duì)照組(db/m組)。

1.3 標(biāo)本收集 代謝籠收集24 h尿液;股動(dòng)脈取血，分離血清;用于生化指標(biāo)檢測(cè)。切取腎臟去被膜后，取部分腎皮質(zhì)置予4%多聚甲醛固定，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè);取部分腎皮質(zhì)置予4%戊二醛固定，用于制備電鏡標(biāo)本;剩余部分腎皮質(zhì)冷凍于-80℃冰箱，用于提取組織蛋白和組織勻漿用。

1.4 血尿生化指標(biāo)檢測(cè) 用AU2700型自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血糖、血尿酸、血尿素氮、血甘油三酯、24 h尿蛋白定量。

1.5 腎組織勻漿MDA濃度的檢測(cè) 稱取100 mg腎實(shí)質(zhì)，放入含有生理鹽水的勻漿器內(nèi)充分勻漿，制成10%的組織勻漿液，3 000 r/min離心15 min，取上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。取10%腎組織勻漿50 μl，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA酶含量，以μmol/g Pro表示。

1.6 免疫組化檢測(cè)腎皮質(zhì)prohibitin、AIF的表達(dá) 4 μm石蠟切片經(jīng)梯度脫蠟;3%H2O2室溫孵育10 min;0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液微波抗原修復(fù)98℃ 20 min;10%正常山羊血清37℃封閉30 min;然后分別以兔抗prohibitin(1∶100稀釋)及兔抗AIF(1∶200稀釋)多克隆抗體4℃孵育過(guò)夜;滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育30 min;滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素，37℃孵育30 min;二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，光鏡觀察;應(yīng)用HPIAS-2000高清彩色病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集及半定量分析。

1.7 Western印跡檢測(cè)腎皮質(zhì)prohibitin、AIF的表達(dá) 分離各組小鼠的腎皮質(zhì)約100 mg，加入RIPA蛋白裂解液，勻漿器勻漿后冰浴30 min，4℃12 000 r/min離心，取上清為組織總蛋白;二喹啉甲酸二鈉鹽(BCA)法進(jìn)行蛋白定量。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)蛋白電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏氟丙(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h;洗膜后加入兔抗prohibitin多克隆抗體(1∶1 000);兔抗 AIF多克隆抗體(1∶1 000)，4℃過(guò)夜;再次洗膜后加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶4 000稀釋)，37℃孵育2 h;洗膜后加電化學(xué)發(fā)光法(ECL)試劑發(fā)光，Gel-pro分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以目的條帶與β-actin條帶光密度比值作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 透射電鏡觀察腎小管上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 腎組織4%戊二醛溶液固定后，經(jīng)脫水、滲透、包埋，制作超薄切片，透射電鏡下觀察腎小管上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變。

1.9 原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞凋亡4 μm腎組織石蠟切片脫蠟、水合后加入蛋白酶 K室溫消化10 min;再次浸入4%多聚甲醛中，5 min后磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗;滴加rTdT，置于濕盒內(nèi)避光37℃孵育60 min后置于2×檸檬酸鈉緩沖液(SSC)中，室溫放置15 min，終止反應(yīng);PBS漂洗后置于新鮮配置的碘化丙啶(PI)溶液(1 μg/ml)中，室溫放置15 min，去離子水漂洗后，防淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。(520±20)nm熒光下觀察綠色熒光;＞620 nm熒光下觀察紅色的PI。細(xì)胞核中有綠色熒光者為陽(yáng)性細(xì)胞(凋亡細(xì)胞)。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×400)計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/100為凋亡指數(shù)(AI)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用s表示，多樣本組間比較采用單樣本方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 血尿生化指標(biāo)變化 在12 w末db/db組血糖、血尿酸、血尿素氮、血甘油三酯及24 h尿蛋白定量水平均明顯高于db/m組(P＜0.05)，db/db+A組血尿酸、血尿素氮及24 h尿蛋白定量水平較同時(shí)期db/db組降低(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 各組小鼠腎組織MDA含量的變化 db/db組小鼠腎組織勻漿MDA濃度明顯高于db/m組(P＜0.05);db/db+A組較db/db組有所下降(P＜0.05)，但仍高于正常對(duì)照組。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠12 w末血尿生化指標(biāo)和腎皮質(zhì)MDA含量比較(s，n=6)

表1 各組小鼠12 w末血尿生化指標(biāo)和腎皮質(zhì)MDA含量比較(s，n=6)

與 db/m 組比較:1)P＜0.05;與 db/db組比較:2)P＜0.05;圖2 同

組別 血糖(mmol/L)血尿酸(μmol/L)尿素氮(mmol/L)甘油三酯(mmol/L)尿蛋白(mg/24h)MDA(μmol/g.pro).21 5.14±0.85 1.36±0.12 db/db 29.13±4.561) 166.35±36.581) 9.45±1.371) 3.39±0.871) 45.44±5.551) 2.64±0.331)db/db+A 27.46±6.111) 80.74±13.052) 7.75±0.862) 2.97±0.631) 22.78±2.622) 1.79±0.152)db/m 6.27±1.13 68.54±12.17 6.29±0.95 0.42±0

2.3 各組小鼠腎組織prohibitin、AIF蛋白的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示:在db/m組可見(jiàn)prohibitin蛋白的陽(yáng)性表達(dá)，主要定位于腎小管上皮細(xì)胞和腎間質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)，胞核內(nèi)亦有較弱表達(dá)，在腎小球固有細(xì)胞無(wú)明顯陽(yáng)性表達(dá)。db/db組prohibitin蛋白表達(dá)強(qiáng)度較db/m組減弱，db/db+A組prohibitin蛋白表達(dá)仍低于db/m組，但較db/db組有所增強(qiáng)。正常對(duì)照組AIF陽(yáng)性表達(dá)弱，主要分布在腎小球固有細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞核周圍的胞質(zhì)中，染色淺而少;db/db組AIF陽(yáng)性表達(dá)明顯增多、增強(qiáng)，且胞核亦可見(jiàn)少量表達(dá)，提示核轉(zhuǎn)位的可能;db/db+A組AIF蛋白表達(dá)低于db/db組。見(jiàn)圖1。

Western印跡結(jié)果顯示:與db/m組相比，db/db組小鼠腎皮質(zhì)內(nèi)Prohibitin蛋白表達(dá)減弱(P＜0.01)，db/db+A組較 db/db組有所增強(qiáng)(P＜0.01)，AIF蛋白在db/m組表達(dá)很低，而db/db組較正常對(duì)照組明顯增強(qiáng)(P＜0.01);db/db+A組較db/db組有所下降(P＜0.01)。見(jiàn)圖2。

2.4 各組小鼠腎小管上皮細(xì)胞電鏡表現(xiàn) 電鏡結(jié)果顯示，db/db組腎小管上皮細(xì)胞中線粒體出現(xiàn)腫脹、空泡變、膜及內(nèi)部嵴結(jié)構(gòu)消失等病理改變，而db/db+A組線粒體病變較db/db組減輕。見(jiàn)圖3。

圖1 各組小鼠12 w末腎組織prohibitin、AIF蛋白表達(dá)(免疫組化，×400)

圖2 各組小鼠12 w末腎組織prohibitin、AIF蛋白表達(dá)(Western印跡)

圖3 各組小鼠12周末腎小管上皮細(xì)胞電鏡表現(xiàn)(×12 000)

2.5 TUNEL檢測(cè)結(jié)果 12 w末，正常對(duì)照組小鼠偶見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞凋亡，db/db組小鼠腎小管上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞凋亡數(shù)量較db/m組明顯增多 (P＜0.01)，db/db+A組腎小管上皮細(xì)胞凋亡少于db/db組，但仍高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 各組小鼠腎組織細(xì)胞凋亡情況(TUNEL，×400)

3 討論

高尿酸血癥作為代謝綜合征的重要組分，其對(duì)T2DM及其并發(fā)癥的影響越來(lái)越不容忽視。有研究指出血尿酸是T2DM患者尿白蛋白排泄率的獨(dú)立相關(guān)因素〔2〕。另有橫斷面流行病學(xué)調(diào)查顯示，高尿酸血癥是慢性腎臟病進(jìn)展的重要危險(xiǎn)因素〔3〕。目前臨床最常用的降尿酸藥物為別嘌醇，它是次黃嘌呤的同分異構(gòu)體，可抑制黃嘌呤氧化酶活性，進(jìn)而抑制尿酸生成。已有臨床隨機(jī)雙盲對(duì)照試驗(yàn)證實(shí)，別嘌醇可降低DM患者的蛋白尿水平〔4〕。也有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，別嘌醇可改善DM大鼠腎臟損害的進(jìn)程〔5〕。進(jìn)一步提示早期識(shí)別和干預(yù)高尿酸血癥對(duì)延緩DN的進(jìn)展具有重要意義。本研究中別嘌醇干預(yù)組血尿酸、血尿素氮及蛋白尿水平較DM組有所改善，提示降低血尿酸水平確對(duì)DN的進(jìn)展具有保護(hù)作用。

腎小管間質(zhì)纖維化是腎臟病發(fā)展至終末期的共同通路，其嚴(yán)重程度與腎臟疾病的預(yù)后關(guān)系密切。越來(lái)越多的研究已經(jīng)證實(shí)，在DN早期就已有腎小管間質(zhì)的損傷發(fā)生，其進(jìn)展程度和腎功能惡化速度的相關(guān)性較腎小球硬化更為密切〔6〕。既往研究已證實(shí)，DN時(shí)腎小管上皮細(xì)胞可出現(xiàn)與腎小管間質(zhì)損傷程度呈正相關(guān)的凋亡現(xiàn)象，提示細(xì)胞凋亡參與了腎小管間質(zhì)病變進(jìn)程〔7〕。尿酸在腎臟排泄時(shí)可100%通過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)，然后再通過(guò)腎小管上皮細(xì)胞的重吸收和再分泌過(guò)程，最終約為8% ～12%的尿酸排出體外。由此可見(jiàn)，腎小管上皮細(xì)胞是尿酸在腎臟作用最直接的靶細(xì)胞之一，高尿酸可能是誘導(dǎo)腎小管間質(zhì)病變的又一重要危險(xiǎn)因素。既往研究指出，尿酸可能通過(guò)啟動(dòng)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和凋亡等機(jī)制導(dǎo)致腎小管間質(zhì)損傷〔8～10〕，但其中涉及的具體途徑還有待進(jìn)一步證實(shí)。

MDA是病理狀態(tài)下活性氧產(chǎn)生過(guò)多攻擊人體生物膜中的多不飽和脂肪酸，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化形成的脂質(zhì)過(guò)氧化物，檢測(cè)MDA含量常可反映體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度，間接反映細(xì)胞氧化損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)中db/db組小鼠與db/m組相比，腎皮質(zhì)中MDA含量明顯升高，提示db/db組DM小鼠在病變?cè)缙谀I組織內(nèi)氧化與抗氧化的平衡即被打破，腎臟氧化損傷增強(qiáng)。TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示，db/db組小鼠腎小管上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞凋亡數(shù)量較db/m組明顯增多，db/db+A組腎小管上皮細(xì)胞凋亡少于db/db組，提示降低血尿酸水平可減少T2DM腎組織氧化損傷以及腎小管間質(zhì)的細(xì)胞凋亡。

目前認(rèn)為細(xì)胞凋亡可通過(guò)兩條經(jīng)典途徑啟動(dòng)，即線粒體途徑和死亡受體途徑。其中線粒體途徑仍占主導(dǎo)地位。線粒體是細(xì)胞產(chǎn)生活性氧簇的重要部位，活性氧簇參與氧化應(yīng)激反應(yīng)，當(dāng)活性氧表達(dá)增多時(shí)可刺激線粒體膜電位異常，線粒體內(nèi)促凋亡物質(zhì)細(xì)胞色素C，AIF等外溢，激活線粒體凋亡信號(hào)途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。AIF是一種位于線粒體膜間隙、介導(dǎo)非caspase依賴途徑的凋亡相關(guān)蛋白，當(dāng)線粒體凋亡途徑被激活，可致其發(fā)生核轉(zhuǎn)位而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。有研究顯示，尿酸誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損與其致線粒體結(jié)構(gòu)功能異常有關(guān)〔11〕。上述研究結(jié)果提示，在T2DM小鼠模型中，高尿酸血癥所致細(xì)胞氧化損傷與凋亡可能均與線粒體結(jié)構(gòu)和功能正常與否關(guān)系密切。本實(shí)驗(yàn)電鏡結(jié)果顯示，db/db組腎小管上皮細(xì)胞中線粒體出現(xiàn)腫脹、膜及內(nèi)部嵴結(jié)構(gòu)消失等病理改變，而db/db+A組線粒體病變較db/db組減輕。提示抑制尿酸水平對(duì)于維持T2DM腎小管上皮細(xì)胞線粒體正常結(jié)構(gòu)有益。

2011年，Quan等〔12〕應(yīng)用尿酸刺激腎小管上皮細(xì)胞檢測(cè)出數(shù)十種與細(xì)胞增殖和凋亡有關(guān)的蛋白變化，并指出其中prohibitin可能與腎小管上皮細(xì)胞凋亡有關(guān)。Prohibitin是一種廣泛分布于多種生物細(xì)胞中高度保守的蛋白，根據(jù)細(xì)胞種類不同，其可定位于線粒體內(nèi)膜、細(xì)胞核、細(xì)胞膜中，參與細(xì)胞增殖、分化、衰老、凋亡等多種生物學(xué)進(jìn)程。但其最早是作為線粒體內(nèi)膜上的分子伴侶蛋白被發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識(shí)的，研究顯示，Prohibitin參與了線粒體呼吸鏈復(fù)合物亞單位的裝配過(guò)程并可維護(hù)mtDNA的正常結(jié)構(gòu)和復(fù)制數(shù)量，提示Prohibitin在維持線粒體的結(jié)構(gòu)和功能方面意義重大〔13〕。黃文彥等〔14〕在分析腎間質(zhì)纖維化大鼠的基因表達(dá)譜時(shí)也發(fā)現(xiàn)了prohibitin明顯下調(diào)，且其主要表達(dá)于腎小管間質(zhì)細(xì)胞，而腎小球固有細(xì)胞表達(dá)卻極少，推測(cè)其可能是介導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化的重要基因之一。還有研究報(bào)道，prohibitin缺失可誘導(dǎo)胰島B細(xì)胞線粒體損傷進(jìn)而影響細(xì)胞功能和存活，這可能是導(dǎo)致DM進(jìn)展的機(jī)制之一〔15〕。Prohibitin還可抑制H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡〔16〕。提示prohibitin在維持細(xì)胞線粒體正常結(jié)構(gòu)和功能，抑制細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮了重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示別嘌醇可能通過(guò)降低T2DM小鼠血尿酸水平，進(jìn)而抑制腎小管間質(zhì)細(xì)胞prohibitin蛋白表達(dá)下調(diào)，減輕線粒體結(jié)構(gòu)和功能損傷，使線粒體內(nèi)活性氧生成減少，細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕，同時(shí)抑制線粒體信號(hào)途徑啟動(dòng)后AIF核轉(zhuǎn)位誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，達(dá)到防止腎間質(zhì)纖維化的作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，在T2DM小鼠病變?cè)缙诩创嬖谀I組織氧化應(yīng)激損傷和腎小管上皮細(xì)胞的凋亡增加，別嘌醇干預(yù)可減低血尿酸水平，減少腎組織的氧化損傷和細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是通過(guò)維持prohibitin的表達(dá)，穩(wěn)定線粒體結(jié)構(gòu)與功能，抑制活性氧產(chǎn)生和AIF外溢誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

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