單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白1、2在乳腺浸潤性導管癌中的表達變化及其與病理級別之間的關(guān)系

李 倩 何笑冬 舒小鐳 文 軍 李少林 (重慶醫(yī)科大學，重慶 0000)

乳腺癌是世界范圍內(nèi)危害女性人群健康最常見的惡性腫瘤之一〔1，2〕。浸潤性導管癌(IDC)是一種最常見的乳腺癌，80%的乳腺癌都是IDC。單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白家族(MCTs)是位于細胞膜上擔負乳酸等單羧酸及H+跨膜轉(zhuǎn)運的通道蛋白。除轉(zhuǎn)運單羧酸外，MTSs家族成員在催化糖酵解產(chǎn)物乳酸等單羧酸的轉(zhuǎn)運及細胞內(nèi)pH值的調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用。迄今為止，對MCTs基因家族成員研究較為深入的是 MCT 1及 MCT 2。前者主要參與乳酸的跨膜轉(zhuǎn)運〔3〕，而后者則主要參與丙酮酸的跨膜轉(zhuǎn)運〔4〕。研究表明，實體腫瘤細胞以無氧糖酵解作為獲取能量的主要方式，這種代謝特點勢必導致腫瘤細胞內(nèi)乳酸等大量酸性物質(zhì)生成增多，引起細胞內(nèi)環(huán)境的酸化〔5〕。資料顯示，MCT 1，MCT 2和MCT 4蛋白在乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌和卵巢腫瘤中均有高表達〔6〕，然而有關(guān)MCT 1、2在乳腺IDC的表達變化及其病理級別的關(guān)系卻鮮有報道。本研究擬觀察MCT 1和MCT 2在人不同級別乳腺IDC中的表達變化，探討乳腺IDC增殖、生長的分子機制。

1 材料和方法

1.1 病例及標本采集 隨機選擇2013年5～8月在重慶市腫瘤醫(yī)院住院手術(shù)治療的IDC患者37例。分為IDCⅠ級、Ⅱ級、Ⅲ級組;將癌旁相對正常組織為對照組。將收集到的乳腺癌Ⅰ～Ⅲ級的手術(shù)標本及癌旁正常組織部分進行石蠟包埋、切片，部分提取蛋白，置于-80℃冰箱備用。經(jīng)過查詢患者病史及病理檢驗證實，所有患者術(shù)前均未接受免疫治療和放療、化療等。對照組的標本處理方法同前。

1.2 主要試劑 多克隆山羊抗人MCT 1、多克隆兔抗人MCT 2和單克隆小鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH，Santa Cruz公司);辣根酶標記的山羊抗兔IgG、辣根酶標記的山羊抗小鼠IgG、辣根酶標記的鼠抗山羊IgG、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、二抗試劑盒(Dako公司)。

1.3 免疫組織化學顯色 將所取相對正常乳腺組織與各級乳腺IDC的組織常規(guī)固定后，按照程序進行石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度為4 μm。常規(guī)脫蠟后行蘇木素-伊江(HE)染色，進行病理診斷和分級后，選片進行兩步法免疫組織化學顯色，MCT 1一抗?jié)舛葹?∶200，MCT2一抗?jié)舛葹?∶200，DAB 顯色，HE 復染細胞核，磷酸鹽緩沖液(PBS)終止顯色，脫水透明后封片，顯微鏡觀察并照相。陰性對照用0.01 mol/L的PBS代替一抗，其余步驟不變。采用北航(CM-2000B)生物醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析，測定免疫反應(yīng)陽性細胞的積分光密度值。

1.4 Western印跡 用Western印跡和IP細胞裂解液(北京普利萊)提取對照組和各級乳腺浸潤性細胞瘤組織樣品總蛋白，十二烷基硫酸鈉-丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠分離蛋白，通過濕轉(zhuǎn)方式將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，用Western印跡封閉液37℃封閉 1.5 h，分別加入 MCT 1(1 ∶300)、MCT 2(1 ∶300)、GAPDH(1∶500)一抗，4℃過夜孵育，PBS洗膜后分別加入相應(yīng)二抗，37℃孵育2 h，PBS洗膜后DAB試劑盒顯色。用Quantity one軟件轉(zhuǎn)換后測定灰度值，以GAPDH為內(nèi)參對照。

1.5 病理診斷 按照WHO乳腺腫瘤病理學和遺傳學分類(2003年)推薦應(yīng)用經(jīng)Elston和Ellis改良的Bloom-Richardson半定量組織學分級法進行乳腺IDC(非特殊性)的組織學分級。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0軟件，計量資料以s表示，多組均數(shù)進行比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD法。

2 結(jié)果

2.1 病理診斷 乳腺癌IDCⅠ級10例，Ⅱ級12例，Ⅲ級15例，見圖1。

2.2 MCT 1、2的免疫組織化學 對照組和乳腺癌浸潤性癌組織中均有MCT 1和MCT 2的表達。對照組中MCT 1和MCT 2在乳腺導管上皮細胞胞質(zhì)內(nèi)呈弱表達。而在浸潤性導管癌組織，MCT 1和MCT 2主要表達在腫瘤細胞的胞質(zhì)和胞核中，并隨著腫瘤級別的升高，其表達量逐漸增強。圖像分析結(jié)果顯示，與對照組比較，MCT 1和MCT 2在乳腺癌浸潤性癌組織的表達明顯升高(P＜0.05);不僅如此，不同病理級別的乳腺IDC細胞中MCT 1和MCT 2的表達，也具有顯著性差異(P＜0.05)。從平均光密度值來看，MCT1和MCT2的表達模式具有一定的差異。見圖1，表1。

圖1 乳腺浸潤性導管癌病理分級和MCT1、MCT2在各腫瘤組及對照組中的表達(HE，×400)

表1 對照組和不同病理級別乳腺浸潤性導管癌組織中MCT1和MCT2的IOD值(s)

表1 對照組和不同病理級別乳腺浸潤性導管癌組織中MCT1和MCT2的IOD值(s)

與對照組比較:1)P＜0.05;與各組間比較:2)P＜0.05

MCT1 MCT2對照組組別 n 37 6.11±0.12 3.27±0.17Ⅰ級組 10 23.32±0.331)2) 22.57±0.141)2)Ⅱ級組 12 46.91±0.111)2) 30.33±0.201)2)Ⅲ級組 15 67.49±0.231)2) 51.25±0.211)2)

2.3 MCT 1、2的Western印跡檢測 各腫瘤組織中均可見MCT 1和MCT 2條帶，與對照組相比，MCT 1和MCT 2在腫瘤組織中表達增強(P＜0.05)，并隨著腫瘤組織病理級別的升高，MCT 1、2表達增強(P＜0.05)，各腫瘤組織之間相比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖2。

圖2 人不同級別乳腺浸潤性導管細胞瘤組織及對照組中MCT1、MCT2的蛋白表達

3 討論

乳腺癌是高度異質(zhì)性的腫瘤，其中IDC占絕大多數(shù) ，與其他類型乳腺癌相比較，其具有更加復雜的腫瘤細胞生物學行為。我國華東地區(qū)乳腺癌的發(fā)生率和病死率高于中西部地區(qū);與西方發(fā)達國家相比較，中國患者發(fā)病年齡提前約10～15年，并可能伴有生物學標志物的改變〔2，7〕。腫瘤細胞生長在相對缺氧的環(huán)境中，其能量代謝的特點是有氧糖酵解。在酵解過程中，腫瘤細胞在獲取能量的同時，必將伴隨乳酸、丙酮酸等酸性產(chǎn)物的大量堆積，導致細胞內(nèi)pH下降，引起腫瘤細胞內(nèi)的酸化和凋亡。而腫瘤細胞內(nèi)pH的降低，可抑制腫瘤細胞內(nèi)原癌基因的激活，增強腫瘤對多種理化因素和化療藥物的易感性，從而誘導細胞凋亡〔8，9〕。然而，有資料顯示，腫瘤細胞內(nèi)的pH值呈反向分布，即細胞內(nèi)的pH值高于細胞外，相對于細胞外，細胞內(nèi)更趨向于堿化〔10，11〕，而細胞內(nèi)的堿化，與 MCTs表達異常有關(guān)。

MCTs是一類重要的跨膜轉(zhuǎn)運載體，涉及多種生物學功能。MCTs單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白家族也叫SLC16基因家族，迄今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了14種亞型，分別命名為MCT 1～9、MCT 11～14和T型氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白-1(TAT-1)，而MCT 8則被認為是甲狀腺激素轉(zhuǎn)運體。由于MCTs家族成員可介導糖酵解產(chǎn)物乳酸等單羧酸及H+的跨膜轉(zhuǎn)運，因此MCTs對細胞內(nèi) pH值的調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用。資料顯示〔12〕，MCT 1，2可將腫瘤細胞內(nèi)的乳酸和H+以1∶1的方式轉(zhuǎn)運到細胞外，升高細胞內(nèi)的pH值，堿化細胞內(nèi)環(huán)境，從而抑制腫瘤細胞的凋亡，促進腫瘤細胞的增殖和生長。在MCT家族的研究中，MCT 1，MCT 2是發(fā)現(xiàn)最早的兩個亞型，因此對其的研究也相對較為深入?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，MCT 1幾乎存在于所有的組織細胞中，而MCT 2僅在幾種組織中有表達，即使在與MCT 1一起表達的同一組織中其組織分布位置也與MCT 1不同，提示其可能有具有不同的功能。盡管目前對MCT 1，MCT 2在正常組織細胞中的分布與功能，特別是MCT 1的功能有了較深入的了解〔13，14〕，但對其在病理情況下，如缺氧、缺血、休克及腫瘤等病理性乳酸產(chǎn)生增高方面的相關(guān)研究報道卻并不多見。

本研究結(jié)果提示，乳腺IDC中MCT 1、2的高表達，有利于無氧糖酵所產(chǎn)生的酸性物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運，減少其在細胞內(nèi)的堆積，從而堿化乳腺癌細胞內(nèi)環(huán)境，抑制乳腺癌細胞的凋亡，促進乳腺癌細胞的增殖和生長。因此，如能通過化療藥物或反義基因治療抑制MCT的表達，促使腫瘤細胞內(nèi)環(huán)境過度酸化而死亡，將不失為一種治療乳腺癌的一條新思路。

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