改良大鼠腹主動脈瘤模型的建立

武亞麗 童雪影 鄭紅波 周洪蓮 (華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院老年病科，湖北 武漢 430030)

近年來對腹主動脈瘤(AAA)的發(fā)病機制有了較新的認識。主動脈壁中巨噬細胞及淋巴細胞浸潤，可以產(chǎn)生大量的細胞因子激活蛋白水解酶，進而導(dǎo)致基質(zhì)蛋白改變?nèi)鐝椓w維減少，膠原纖維相對增加，從而引起主動脈壁的硬度、彈性發(fā)生變化，久而久之形成動脈瘤〔1～3〕。因此在對AAA的研究過程中，建立一個簡便、快速、穩(wěn)定的AAA動物模型可以更好的研究其發(fā)病機制。本實驗觀察比較選擇其中一種動物模型的病理狀態(tài)能夠大致重現(xiàn)人類AAA發(fā)病過程的方法。

1 材料與方法

1.1 動物分組及處理 選用SD雄性大鼠50只，每只體重約300 g，隨機分為彈力蛋白酶(Elastase)組、CaCl2組、CaCl2+Elastase組、生理鹽水組、正常組，每組10只，大鼠以3%戊巴比妥鈉(0.2 ml/100 g)腹腔內(nèi)注射麻醉，剖腹后在10倍手術(shù)顯微鏡(天津醫(yī)用光學(xué)儀器廠產(chǎn))下游離出腎靜脈水平以下約1 cm長的腹主動脈，測量腹主動脈的直徑，結(jié)扎腸系膜下動脈。6-0絲線在腎靜脈水平下端及腹主動脈髂動脈分叉處分別進行結(jié)扎腹主動脈，進而在腹主動脈下端分叉結(jié)扎處上方造口，待結(jié)扎中段的少量血液流出后，插入PE-10導(dǎo)管并保持導(dǎo)管頭端處于腎靜脈下端的結(jié)扎線處，最后在造口處的頭端以6-0絲線結(jié)扎固定導(dǎo)管。Elastase組:經(jīng)三通管先打入PE-10導(dǎo)管中約1.0 ml生理鹽水稀釋的Elastase(20 U)灌注，三通管的另一頭用注射用導(dǎo)管接136 cm高處的生理鹽水袋(造成的灌注壓力約為100 mmHg)，此狀態(tài)持續(xù)30 min;CaCl2組:用CaCl2液體浸潤過的濕潤紗布包繞在腹主動脈組織表面，持續(xù)10 min;CaCl2+Elastase組:灌注 Elastase(方法同 Elastase組)30 min的過程中同時用浸潤有CaCl2溶液的紗布包繞在腹主動脈表面，時間為10 min;生理鹽水組:對照組打入1.0 ml生理鹽水，三通管的另一頭用導(dǎo)管接136 cm高處的生理鹽水袋(造成的灌注壓力約為100 mmHg)，持續(xù)30 min。正常組:未做任何處理。術(shù)后第14天，再次用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，剖腹后分離腹主動脈周圍組織，游離出腹主動脈。

1.2 計算腹主動脈直徑擴張率 游離出大鼠腹主動脈后測量每只大鼠術(shù)后的腹主動脈直徑，然后以公式:(大鼠術(shù)后主動脈直徑/術(shù)前直徑)×100%，來計算大鼠的直徑擴張率。

1.3 標(biāo)本的采集和處理 處死大鼠，剪取腹主動脈組織置于生理鹽水中將殘留的血液沖洗干凈后用4%多聚甲醛固定12 h。

1.4 切片染色 將固定好的一部分組織經(jīng)脫水透明、浸蠟包埋、切片、脫蠟后行HE染色和維多利亞藍染色;另一部分行平滑肌細胞凋亡TUNEL檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.0軟件進行獨立樣本t檢驗和Fisher確切概率法。

2 結(jié)果

2.1 大鼠生存狀態(tài)及腹主動脈直徑擴張率 Elastase組大鼠造模術(shù)后死亡2只，存活8只;CaCl2+Elastase組大鼠術(shù)后死亡3只，存活7只;CaCl2組、生理鹽水組大鼠全部存活。Elastase組大鼠腹主動脈直徑平均擴張率為220.3%，CaCl2組大鼠腹主動脈直徑平均擴張率為100%，CaCl2+Elastase組大鼠腹主動脈直徑平均擴張率為220.3%，生理鹽水組大鼠腹主動脈直徑平均擴張率為112.3%，正常組為100%。其中Elastase、CaCl2+Elastase組大鼠腹主動脈直徑擴張率顯著高于生理鹽水組、正常組，Elastase、CaCl2+Elastase組分別與生理鹽水組比較差異顯著 (P＜0.05);Elastase、CaCl2+Elastase組分別與正常組比較，差異顯著 (P＜0.05);Elastase組與CaCl2+Elastase組之間腹主動脈直徑擴張率基本沒有變化;CaCl2組分別與生理鹽水組、正常組相比無顯著差異 (P＞0.05);生理鹽水組與正常組相比也無明顯差異 (P＞0.05)。見圖1。

2.2 HE染色 正常組腹主動脈有清晰的彈力層將內(nèi)、中、外膜分開，內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞排列整齊;生理鹽水組灌注生理鹽水2 w后，動脈壁的內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞有輕微改變但動脈壁各層結(jié)構(gòu)仍較清晰;而Elastase、CaCl2、CaCl2+Elastase組的腹主動脈壁較前兩組相比，其彈力纖維降解甚至消失，各層結(jié)構(gòu)分界不明顯，動脈壁破壞明顯;其中CaCl2組、CaCl2+Elastase組與Elastase組相比，有明顯的炎癥細胞浸潤。見圖2。

圖1 各組大鼠腹主動脈直徑擴張率(×10)

圖2 各組大鼠腹主動脈的HE染色結(jié)果(×100)

2.3 維多利亞藍彈力纖維特殊染色 生理鹽水組、正常組腹主動脈壁結(jié)構(gòu)整齊，彈力纖維排列均勻;CaCl2組彈力纖維少量減少，膠原纖維相對增加;Elastase、CaCl2+Elastase組血管中層平滑肌細胞變性、萎縮，彈力纖維明顯消失，膠原纖維量大量增加。Elastase、CaCl2+Elastase組分別與CaCl2組相比，彈力纖維明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.05)，但 Elastase，CaCl2+Elastase組間相比，彈力纖維量的差別沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹥0.05)。見圖 3。

2.4 平滑肌細胞凋亡的檢測 平滑肌細胞凋亡TUNEL檢測可見CaCl2組、生理鹽水組、正常組腹主動脈壁結(jié)構(gòu)整齊，沒有發(fā)現(xiàn)凋亡小粒;Elastase、CaCl2+Elastase組中均有凋亡小粒存在;Elastase、CaCl2+Elastase組分別與CaCl2組、生理鹽水組、正常組兩兩相比，陽性表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.05);但Elastase，CaCl2+Elastase組間相比，其陽性表達量差異沒有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P﹥0.05)。見圖4。

圖3 各組大鼠腹主動脈維多利亞藍彈性纖維染色結(jié)果(×100)

圖4 各組大鼠腹主動脈平滑肌細胞凋亡結(jié)果(×100)

3 討論

AAA是腹主動脈在各種病理因素作用下以局部擴張向外膨隆為主要表現(xiàn)的大血管疾病，好發(fā)于60歲以上的老年人群，瘤體一旦破裂，死亡率高達50% ～80%。目前用于AAA機制研究的模型多為中外膜損傷模型，如基因缺陷誘導(dǎo)法〔2～4〕、彈力蛋白酶灌注法〔5，6〕、CaCl2〔7〕涂抹法等。其中有國外學(xué)者用基因敲除小鼠作為模型，但此方法對動物的飼養(yǎng)、繁殖條件要求嚴格，且來源有限，對開展實驗研究有一定限制。所以建立簡便、快速、穩(wěn)定的AAA動物模型十分必要。

Anidjar等創(chuàng)立了彈力酶灌注法建立AAA模型的方法。此方法的原理是彈力蛋白酶誘導(dǎo)大鼠腹主動脈壁損傷，引起腹主動脈炎癥反應(yīng)，動脈壁結(jié)構(gòu)蛋白代謝平衡被打亂從而造成主動脈壁破壞，致使主動脈壁彈性減弱并逐漸擴張造成AAA的發(fā)生發(fā)展。后經(jīng)過不斷改進，改變切口部位，縮短彈力蛋白酶灌注時間等方法〔8〕，使建立AAA模型的方法越來越方便。人類AAA的病理生理改變?yōu)?①腹主動脈直徑擴張為原直徑的150%〔8〕;②主動脈中層細胞外基質(zhì)進行性破壞，特別是彈性纖維減少，膠原纖維相對增加，造成主動脈壁彈性減退硬度增加并擴張;③炎性細胞產(chǎn)生，基質(zhì)中細胞因子等發(fā)生改變。④主動脈中層平滑肌細胞大量凋亡。綜上，AAA的發(fā)病過程大致是:血管平滑肌細胞可產(chǎn)生彈力纖維及膠原纖維等細胞外基質(zhì)以保證血管的結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定。當(dāng)血管平滑肌細胞受到炎癥細胞，細胞因子等多種因素的作用后會大量凋亡，其所能產(chǎn)生的細胞外基質(zhì)也發(fā)生改變，其中彈性纖維減少，膠原纖維相對增加，使得血管壁中層的基質(zhì)代謝失衡，致使腹主動脈難以抵抗血流沖擊而擴張，這個過程是較長時間逐漸形成的慢性過程。本實驗中人工向大鼠腹主動脈中灌注豬彈力蛋白酶的過程是一個較短暫的過程，并不能引起如人類AAA中較明顯的炎癥細胞浸潤表現(xiàn)。以浸潤有氯化鈣溶液的紗布浸潤雖可以模擬該炎癥過程但直徑擴張率并不理想，不足以稱其為AAA。而Elastase+CaCl2組則結(jié)合了該兩種方案中的優(yōu)點，使之更加符合人體AAA的病理特點，并且術(shù)后2 w測量大鼠AAA直徑大于原直徑的150%，維多利亞藍彈力纖維染色發(fā)現(xiàn)彈力纖維層顯著減少，HE染色可見炎癥細胞明顯浸潤，并且凋亡試驗中也可觀察到凋亡小體存在。因此，本實驗中Elastase+CaCl2共同作用構(gòu)建出來的大鼠AAA是用于研究AAA發(fā)病機制及治療措施的較好動物模型。

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