p-STAT3與缺氧誘導(dǎo)因子在結(jié)腸癌組織中的表達及其臨床意義

張曉芹 史迎莉 賈小云 李 濤 王 軍 張 紅 (陜西中醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院，陜西 咸陽 7046)

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子(STAT)是信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子家族成員之一，在多種細胞生長、分化、凋亡及其功能發(fā)揮過程中起著重要的作用〔1〕。STATs是1992年在研究干擾素誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄時鑒定出的一個胞質(zhì)蛋白家族，目前已發(fā)現(xiàn)哺乳動物STAT家族有7個成員，而STAT3磷酸化水平反映STAT通路的活化狀態(tài)〔2〕。STAT3正常呈無活性狀態(tài)，在Janus激酶的作用下發(fā)生磷酸化成為磷酸化的STAT(p-STAT3)，p-STAT3分子形成二聚體，繼而進入細胞核與特異的DNA序列結(jié)合，調(diào)節(jié)下游相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達〔3〕。STAT3活化可以誘導(dǎo)多種與細胞增殖、分化、凋亡等生物學行為密切相關(guān)的下游靶基因的表達〔4〕。缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)存在于哺乳動物及人體內(nèi)，可調(diào)節(jié)多種靶基因的表達，與多種腫瘤細胞的凋亡和增殖有關(guān)〔5〕。Jung等〔6〕發(fā)現(xiàn) ST AT3 可以抑制 HIF-1α 的降解，增加HIF-1α的合成，與HIF-1α共同調(diào)節(jié)腫瘤細胞生長因子的轉(zhuǎn)錄，提示ST AT3是調(diào)控HIF-1α表達的重要轉(zhuǎn)錄因子。目前研究發(fā)現(xiàn)，STAT3的持續(xù)活化與白血病、胃癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞的異常增殖密切相關(guān)〔7〕，但STAT3調(diào)控結(jié)腸癌的機制尚不清楚，本實驗探討p-STAT3在結(jié)腸癌發(fā)病中的作用和機制及其對臨床的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料 材料取自陜西中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院2009年4月至2011年3月手術(shù)切除并經(jīng)病理確診為結(jié)腸癌和相應(yīng)的癌旁組織標本40例(癌旁組織經(jīng)病理學證實不含癌細胞)，其中男29例，女11例，年齡44～74歲，全部病例術(shù)前均未接受過放療和化療，組織學分型均為腺癌。

1.2 主要試劑 兔抗人P-STAT3和HIF-1α多克隆抗體購自Santa Cruz公司(SC-21876;SC-10790)，SABC試劑盒及DAB顯色劑購自博士德公司。

1.3 試驗方法 所有標本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。采用免疫化學SABC法，主要步驟如下:切片常規(guī)脫蠟至水，電爐熱抗原修復(fù)10 min;冷卻后采用3%H2O2室溫下孵育15 min;加5%的牛血清室溫下孵育30 min封閉非特異性結(jié)合;滴加一抗 P-STAT(濃度1∶300)、HIF-1 α(濃度1∶200)4℃孵育過夜;滴加二抗(生物素化羊抗兔IgG濃度1∶500)，37℃孵育2 h;滴加 SABC，37 ℃孵育30 min，PBS 液清洗3次，每次5 min;DAB顯色，鏡下控制反應(yīng)時間，顯色適度后蒸餾水沖洗終止顯色;蘇木精輕度復(fù)染細胞核，自來水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.4 結(jié)果判定 采用PBS代替一抗做陰性對照，p-STAT3以細胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性;HIF-1 α以細胞質(zhì)或細胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性;每張切片隨機選取10個高倍視野(×400倍)，每個視野中100個細胞被計數(shù)，計算平均陽性率，陽性細胞數(shù)≥10%為(+)。

1.5 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS10.0軟件進行 χ2檢驗和Spearman等級相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 p-STAT3和HIF-1α蛋白表達定位 p-STAT3和HIF-1α主要表達在細胞核，HIF蛋白陽性信號表達在細胞質(zhì)。

2.2 p-STAT3蛋白在不同結(jié)腸組織中的表達 在40例結(jié)腸癌組織中有37例表達陽性，陽性表達率為92.5%，明顯高于癌旁組織(2.5%，P＜0.01)，見圖1。

圖1 p-STAT3蛋白在不同結(jié)腸組織中的表達(DAB，×200)

2.3 HIF-1α在人不同結(jié)腸組織中的表達 在40例結(jié)腸癌組織中有37例表達陽性，陽性表達率為87.5%，明顯高于癌旁組織(5%，P＜0.01)，見圖2。

2.4 結(jié)腸癌組織中p-STAT3和HIF-1α表達的關(guān)系 結(jié)腸癌組織中p-STAT3和 HIF-1α的陽性表達強度呈正相關(guān)(r=0.313，P＜0.05)。

圖2 HIF-1α蛋白在不同結(jié)腸組織中的表達(DAB，×200)

3 討論

研究提示STAT3的持續(xù)激活可導(dǎo)致細胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化〔7〕，本實驗提示STAT3的激活與結(jié)腸癌細胞增殖密切相關(guān)。pSTAT3檢測可作為結(jié)腸癌診斷的重要標志物。

HIF-1 α存在于哺乳動物及人體內(nèi)，研究發(fā)現(xiàn)HIF-1 α高表達的惡性腫瘤大多分化差，進展快、血管生成密度高、易發(fā)生轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)、預(yù)后差〔8〕。目前確定多種因子受到HIF-1 α的調(diào)控，包括VEGF及血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)、腺苷酸激酶3、促紅細胞生成素(EPO)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)等，涉及參與腫瘤細胞的能量代謝、增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、耐藥及血管新生等多個方面。HIF-1 α的活性對維持腫瘤細胞能量代謝、促進腫瘤血管生成、促進腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移起重要作用，并與腫瘤細胞的凋亡和增殖有關(guān)〔9〕。

本研究結(jié)果顯示:p-STAT3和HIF-1α在結(jié)腸癌組織中高表達，明顯高于癌旁組織，且二者呈正相關(guān)。研究結(jié)果表明，p-STAT3和HIF-1 α的過度表達在結(jié)腸癌的診斷中具有重要價值，有望成為判斷結(jié)腸癌惡性程度的新指標。STAT3可通過促癌基因或抑癌基因的異常表達促進腫瘤細胞的分裂繁殖，HIF可通過VEGF促進腫瘤血管形成，為腫瘤細胞不斷生長提供物質(zhì)供應(yīng)，p-STAT3和HIF-1 α在結(jié)腸癌組織中所呈現(xiàn)的正相關(guān)提示:p-STAT3可能通過促進HIF的轉(zhuǎn)錄共同促進結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展。而STAT3和HIF在腫瘤發(fā)展中的直接關(guān)系，尚有待進一步研究。

1 張 偉，吳 強，譚德明.STAT3小干擾RNA的構(gòu)建及其對胃癌細胞增殖和凋亡的影響〔J〕.第二軍醫(yī)大學學報，2007;29(7):603-5.

2 Atreya R，Mudter J，F(xiàn)inotto S，et al.Blockade of interleukin 6 trans signaling suppresses T-cell resistance against apoptosis in chronic intestinal inflammation:evidence in crohn disease and experimental colitis in vivo〔J〕.Nat Med，2000;6(5):583-8.

3 Demoulin JB，van Roost E，Steven M，et al.Distinct roles for STAT1、STAT3 and ST-AT5 in differentiation gene induction and apoptosis inhibition by interleukin-9〔J〕.Biol Chem，1999;274(36):25855-61.

4 Ma XT，Wang S，Ye YJ，et al.Constitutive activation of Stat3 signaling pathway in human colorectal carcinoma〔J〕.World J Gastroenterol，2004;10(11):1569-73.

5 Nishi H，Nakada T，Kyo S，et al.Hypoxia inducible factor 1 mediate up regulation of telomerase(h TERT)〔J〕.Mol Cell Biol，2004;24(13):6076-83.

6 Jung JE，Lee HG，Choi H，et al.STAT3 is a potential modulator of HIF-l mediated VEGF expression in hum an renal carcinoma cells〔J〕.FASEB J，2005;19(10):1296-8.

7 Niu G，Wright KL，Huang M，et al.Constitutive STAT3 activity up-regulates VEGF expression and tumor angiogenesis〔J〕.Oncogene，2002;21(13):2000-8.

8 張劍虹，張 飛，張 凡，等.老年乳腺癌MGMT、GST-P、H IF-1α表達與臨床預(yù)后關(guān)系的組織芯片研究〔J〕.中國老年學雜志，2009;29(7):1600-2.

9 樊利芳，刁路明.低氧誘導(dǎo)因子-1α在結(jié)直腸腺癌中的表達及意義〔J〕.中華病理學雜志，2004;6(33):242-6.