百草枯致肺纖維化大鼠肺組織中Smo、Gli1的表達(dá)變化及意義

周媛媛，曾凡軍

(1三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，湖北宜昌443000;2宜昌市中心人民醫(yī)院)

百草枯(PQ)是聯(lián)吡啶類(lèi)除草劑，中毒后出現(xiàn)的不可逆的肺間質(zhì)纖維化是主要致死原因，病死率高達(dá)80%，但中毒機(jī)制不明。Sonic hedgehog(SHH)信號(hào)途徑是肺臟結(jié)構(gòu)形成和發(fā)育過(guò)程中重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［1］，其在肝、腎等器官纖維化過(guò)程中均存在異?；罨F(xiàn)象［2］。SHH途徑是否參與PQ所致肺纖維化目前尚不清楚。Smo和Gli1是SHH途徑的2個(gè)重要分子［3～5］，本研究通過(guò)檢測(cè) PQ致大鼠肺纖維化后Smo和Gli1的表達(dá)，探索SHH信號(hào)途徑在PQ致大鼠肺纖維化中的作用，進(jìn)一步了解PQ致肺纖維化的中毒機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 PQ農(nóng)藥購(gòu)于鄭州沙隆達(dá)植物保護(hù)技術(shù)有限公司(農(nóng)藥登記證號(hào):PD20090712)。雄性SD健康大鼠40只，來(lái)自三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF 級(jí)，體質(zhì)量(255±25)g。

1.2 分組及模型制備方法 40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為2組:PQ組、生理鹽水對(duì)照組(NS組)，每組20只。PQ組一次性腹腔注入PQ農(nóng)藥40 mg/kg;NS組一次性腹腔注射生理鹽水40 mL/kg。21 d后處死大鼠，開(kāi)胸取右肺組織。

1.3 大鼠肺組織病理組織學(xué)檢查 觀察兩組大鼠肺組織外觀后，石蠟切片HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。

1.4 Smo和Gli1免疫組化檢測(cè) 采用SP法。免疫組化試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司，免疫組化檢測(cè)嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。組織脫蠟，0.3%H2O2阻斷過(guò)氧化酶活性;抗原熱修復(fù)處理后;以稀釋的兔抗Smo和Gli1多克隆抗體孵育過(guò)夜，陰性對(duì)照用PBS代替一抗，二抗采用山羊SABC過(guò)氧化物酶試劑盒，再用DBA試劑盒顯色。按照肺組織細(xì)胞胞膜及胞質(zhì)或胞核出現(xiàn)的黃色、棕黃或褐色顆粒作為染色強(qiáng)度判斷標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合著染細(xì)胞和組織分布范圍大小，綜合整個(gè)切片，雙盲法由2位病理科醫(yī)生對(duì)每張切片染色結(jié)果獨(dú)立進(jìn)行評(píng)估:無(wú)表達(dá)(-)、弱表達(dá)(±)、低表達(dá)(+)、中表達(dá)(++)、高表達(dá)(+++)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩變量間的相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

NS組大鼠肺臟外觀肺組織色澤紅潤(rùn)，表面光滑，彈性好。光鏡觀察未出現(xiàn)明顯病理改變。PQ組大鼠肺臟外觀肺組織呈蒼白色，表面凹凸不平、呈結(jié)節(jié)樣改變及條索狀凹溝，體積縮小，硬度增加。光鏡觀察發(fā)現(xiàn)肺組織部分實(shí)變，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，部分肺泡腔消失，為大量膠原纖維、成纖維細(xì)胞增生。見(jiàn)圖1。

2.1 Smo和Gli1檢測(cè)結(jié)果 Smo和Gli1蛋白主要分布于支氣管上皮、肺泡上皮、血管內(nèi)皮細(xì)胞及部分纖維組織。Smo陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜及胞質(zhì)，Glil陽(yáng)性表達(dá)主要定位于胞質(zhì)及胞核。Smo及Gli1在NS組無(wú)表達(dá)或弱表達(dá)，在PQ組表達(dá)明顯增強(qiáng)，兩組比較 P＜0.01。見(jiàn)圖2、表1。

圖1 兩組大鼠肺組織光鏡檢查結(jié)果

圖2 Smo和Gli1在兩組大鼠肺組織中的表達(dá)

表1 兩組大鼠肺組織中Smo和Gli1蛋白的免疫組化表達(dá)水平(例)

2.2 Smo和Gli1的相關(guān)性分析 PQ組Smo及Gli1蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.956，P ＜0.001)。

3 討論

PQ是有機(jī)雜環(huán)類(lèi)除草劑，對(duì)人畜具有很強(qiáng)的毒性，病死率極高。機(jī)體中毒后出現(xiàn)不可逆性肺間質(zhì)纖維化［6，7］。但其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，可能與過(guò)度氧化反應(yīng)及基因表達(dá)異常有關(guān)。目前對(duì)PQ所致肺纖維化尚無(wú)特異性治療方法。因此，研究PQ所致肺纖維化機(jī)制不僅可以闡明肺纖維化發(fā)病的機(jī)制，而且對(duì)PQ中毒的治療有重要價(jià)值。

SHH途徑是動(dòng)物體內(nèi)存在的重要信號(hào)途徑。主要由Hedgehog配體(Shh)、2個(gè)膜受體Ptch、Smo及下游的轉(zhuǎn)錄因子Gli組成［8］。Smo和Gli1是SHH途徑的2個(gè)重要分子;Smo蛋白是信息轉(zhuǎn)換器，它能夠?qū)⒓?xì)胞外的SHH信號(hào)轉(zhuǎn)換成細(xì)胞內(nèi)的Gli1信號(hào)，對(duì)SHH信號(hào)途徑具有激活作用。有研究［10］顯示，活化的SHH信號(hào)與組織纖維化具有密切關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注入PQ的大鼠肺臟呈明顯肺纖維化的病理改變，且較注入生理鹽水組大鼠肺組織Smo和Gli1蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)。PQ組Smo及Gli1蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)。由此推斷，PQ所致肺纖維化與SHH信號(hào)被激活有密切關(guān)系，但不清楚激活的SHH信號(hào)通過(guò)何種機(jī)制影響肺纖維化進(jìn)程。推測(cè)可能與 PQ激活 SHH信號(hào)途徑，SHH蛋白和Patch蛋白結(jié)合后，Patch對(duì)Smo抑制解除，通過(guò)胞質(zhì)微管上附著的hedgehog信號(hào)復(fù)合物介導(dǎo)，使轉(zhuǎn)錄因子Gli1進(jìn)入胞核，激活其下游基因表達(dá)［11］，導(dǎo)致肺組織纖維化。

可見(jiàn)，SHH信號(hào)途徑的異常激活可能直接參與了PQ所致肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，而Smo和Gli1蛋白明顯表達(dá)則可能是SHH信號(hào)途徑異常激活的機(jī)制之一。進(jìn)一步研究SHH信號(hào)途徑在PQ致肺纖維化中的作用可能為PQ所致肺纖維化開(kāi)辟新的治療途徑。

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