賁門腺癌組織中RKIP、E-cadherin的表達(dá)變化及相關(guān)性

魏 紅，齊淑靜，劉文利，徐 亮，李麗東，李 華，董稚明，郭 煒，瞿 峰

(1河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院，石家莊050011;2邯鄲市第四醫(yī)院;3河北省腫瘤研究所)

賁門腺癌是我國北方最常見的惡性腫瘤之一，流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，高發(fā)區(qū)賁門腺癌的發(fā)病率和病死率有逐年上升的趨勢。在腫瘤病因?qū)W研究中，人們發(fā)現(xiàn)Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein，RKIP)具有抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。同時發(fā)現(xiàn)上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)在腫瘤細(xì)胞凋亡中起作用，但兩者在賁門腺癌中表達(dá)及相關(guān)性尚無報(bào)道。我們檢測了賁門腺癌中RKIP、E-cadherin表達(dá)變化，并探討其相關(guān)性，為進(jìn)一步治療賁門腺癌提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2008～2013年在河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院手術(shù)治療的經(jīng)病理證實(shí)的160例賁門腺癌患者為研究對象，其中男112例、女48例，年齡37～83(61.8±8.7)歲，其中 ＜60歲66例、≥60歲94例。按UICC和AJCC標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期70例、Ⅲ～Ⅳ期90例。按照腫瘤的病理分期進(jìn)行分級，高分化41例、中等分化54例、低分化65例，所有患者術(shù)前未做放化療。

1.2 試劑 RKIP兔多克隆抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，兔抗人E-cadherin多克隆抗體購自武漢博士德生物工程公司，兔SP免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色液購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，PBS緩沖液購自天津市標(biāo)準(zhǔn)科技有限公司，枸櫞酸修復(fù)液購自天津市博迪化工有限公司。

1.3 RKIP和E-cadherin檢測方法 手術(shù)取癌原發(fā)灶及癌旁非腫瘤組織(距癌組織2～5 cm)，用10%中性甲醛固定標(biāo)本，脫水包埋，切片，厚度3～4 μm，烤片過夜，脫蠟，高壓熱修復(fù)抗原，加一抗，37℃孵育，加二抗，孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，封片。應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測RKIP和E-cadherin，用已知陽性切片做RKIP和E-cadherin陽性對照，用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。RKIP判斷標(biāo)準(zhǔn)為陽性染色定位于細(xì)胞質(zhì)，以胞質(zhì)出現(xiàn)均勻棕黃色顆粒定義為陽性細(xì)胞。參照Fromowitz評分標(biāo)準(zhǔn)，隨即選取5個高倍視野(×400)計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞總數(shù)和陽性細(xì)胞數(shù)，得出陽性細(xì)胞百分率，當(dāng)賁門腺癌組織中存在不同分化程度的區(qū)域時，選擇同一腫瘤組織切片中占優(yōu)勢分化程度的腫瘤區(qū)域進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，陽性細(xì)胞率≤25%為0分，26%～50%為1分，51%～75%為2分，＞75%為3分;再按多數(shù)陽性細(xì)胞呈現(xiàn)的染色強(qiáng)度予以計(jì)分:無顯色為0分、淺棕黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分。將上述兩項(xiàng)得分相加:0分判為“-”、1～2分判為“+”、3～4分判為“++”、5～6分判為“+++”。以“++”和“+++”為RKIP蛋白陽性表達(dá)，“-”和“+”為陰性表達(dá)。由3名有經(jīng)驗(yàn)的臨床病理醫(yī)師閱片，根據(jù)其評分的平均值確定判定結(jié)果。E-cadherin表達(dá)定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)，以細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃褐色或淡黃色顆粒為陽性表達(dá)，參照紀(jì)小尤等提供的免疫組織化學(xué)陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，每張切片陽性細(xì)胞數(shù)≤10%或無陽性著色為陰性，陽性細(xì)胞數(shù)＞10%為陽性。隨機(jī)選擇10個高倍鏡視野(HE×400)，連續(xù)計(jì)數(shù)至少1 000個腫瘤細(xì)胞。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，兩個變量間的關(guān)系采用Spearman秩相關(guān)分析法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 賁門腺癌及癌旁組織中RKIP、E-cadherin的表達(dá) RKIP和E-cadherin在賁門腺癌組織中的表達(dá)率分別為 38.75%(62/160)和 70.62%(113/160)，而在癌旁非腫瘤組織中的表達(dá)率分別為52.50%(84/160)和81.25%(130/160)，RKIP 和 E-cadherin在賁門腺癌組織中的表達(dá)率低于癌旁非腫瘤組織中的表達(dá)率(P均＜0.05)。

2.2 賁門腺癌組織中RKIP、E-cadherin的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 不同性別、年齡的賁門腺癌組織中RKIP和E-cadherin的陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)。不同臨床分期的賁門腺癌組織中RKIP的陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但E-cadherin的陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。不同癌組織分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的RKIP和E-cadherin陽性表達(dá)率間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。見表1。

表1 賁門腺癌組織中RKIP和E-cadherin表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

2.3 賁門腺癌組織中RKIP、E-cadherin表達(dá)的相關(guān)性 賁門腺癌組織中RKIP表達(dá)陰性98例，其中E-cadherin表達(dá)陰性15例、陽性83例;賁門腺癌組織中RKIP表達(dá)陽性62例，其中E-cadherin表達(dá)陰性32例、陽性30例。RKIP和E-cadherin在賁門腺癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.388，P ＜0.01)。

3 討論

Raf是磷脂酞乙醇胺結(jié)合蛋白家族的成員，是高度保守、廣泛表達(dá)的小分子胞質(zhì)蛋白［1］。Yeung等［2］首次發(fā)現(xiàn) RKIP，隨后有研究［3，4］發(fā)現(xiàn) RKIP 不僅可以干擾Raf-1/MEK/ERK信號通路，而且還可以抑制NF-κB和G蛋白偶聯(lián)受體激酶等信號傳導(dǎo)過程。2003年Fu等［5］發(fā)現(xiàn)人C4-2B轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞系明顯減低，并且在小鼠中RKIP的表達(dá)增加與原發(fā)腫瘤血管浸潤的減少和抑制原發(fā)腫瘤的生長有聯(lián)系。2005年Keller等［6］研究進(jìn)一步證明，在良性前列腺組織中RKIP表達(dá)水平最高，而隨著Gleason評分的增加，前列腺癌組織中RKIP表達(dá)水平逐漸減低，在轉(zhuǎn)移的前列腺癌組織中RKIP的mRNA水平和蛋白水平均低于非轉(zhuǎn)移的前列腺癌細(xì)胞，提示RKIP功能的喪失與前列腺癌的轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。在結(jié)直腸癌的研究［7，8］中亦出現(xiàn)相似結(jié)論:在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌中RKIP低表達(dá)，同時RKIP的表達(dá)和腫瘤復(fù)發(fā)和生存率呈負(fù)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中RKIP在賁門腺癌組織中比癌旁組織表達(dá)明顯降低，RKIP在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的賁門腺癌組織中比無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中表達(dá)明顯降低，且RKIP的表達(dá)與年齡、性別及臨床分期無關(guān)，與之前研究結(jié)果基本一致。

研究表明，E-cadherin是鈣黏蛋白家族的重要成員之一，它由723～748個氨基酸組成，其末端位于細(xì)胞外，對Ca2+有高度敏感性，而羧基末端位于細(xì)胞內(nèi)，與肌動蛋白相連，由此形成深層蛋白與細(xì)胞骨架肌支蛋白相連的黏附層，對于維持細(xì)胞形態(tài)和調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附具有重要作用。當(dāng)E-cadherin結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生異常時，其黏附作用降低，細(xì)胞容易從原發(fā)病灶脫離并逃離而發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移［9］。E-cadherin能夠抑制腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶，是重要的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因之一［10］。本研究中，E-cadherin在賁門腺癌組織中比癌旁組織表達(dá)明顯降低，并隨著臨床分期的加深和分化程度的降低其表達(dá)明顯降低，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的賁門腺癌組織中比無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中表達(dá)明顯降低，提示E-cadherin的異常表達(dá)可能與賁門癌的分化、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

RKIP和E-cadherin在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用已在乳腺癌、食道癌、肺癌、胃癌等腫瘤中被證實(shí)，但兩者在賁門腺癌中的相關(guān)性研究尚未見報(bào)道。陸身修等［11］發(fā)現(xiàn)前列腺癌病例中RKIP表達(dá)與E-cadherin的表達(dá)呈正相關(guān)。本研究通過對160例賁門腺癌中RIKP和E-cadherin表達(dá)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn):RKIP與E-cadherin的表達(dá)呈正相關(guān)，說明賁門腺癌組織中RIKP表達(dá)下降，E-cadherin表達(dá)也下降，使細(xì)胞間黏附作用減弱，腫瘤細(xì)胞容易脫落，從而增強(qiáng)其轉(zhuǎn)移能力。RKIP與E-cadherin正相關(guān)性機(jī)制可能是:RKIP通過干擾Raf-1/MEK/ERK信號通路，促進(jìn)鋅指因子對E-cadherin的抑制;RKIP可能通過抑制 Raf，影響TGF-β信號通路［12，13］，使Raf和TGF-β信號的協(xié)同作用加強(qiáng)，導(dǎo)致E-cadherin的表達(dá)下調(diào);基因甲基化致轉(zhuǎn)錄抑制，鋅指因子與E-cadherin，近端啟動子上的E-box結(jié)合，抑制其表達(dá)。

綜上所述，RKIP與E-cadherin均是腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子，在賁門腺癌組織中表達(dá)降低，表達(dá)的降低能促進(jìn)賁門腺癌的淋巴轉(zhuǎn)移并增加其惡性程度，通過聯(lián)合檢測有助于臨床早期對賁門腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)行干預(yù)治療，還可以作為賁門腺癌轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物，對賁門腺癌發(fā)展及預(yù)后判斷具有重要意義。

［1］ Simister PC，Banfield MJ，Brady RL.The crystal structure of PEBP-2，a homologue of the PEBP/RKIP family［J］.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr，2002，58(Pt 6 Pt 2):1077-1080.

［2］Yeung K，Seitz T，Li S，et al.Suppression of Raf-1 kinase activity and MAP kinase signalling by RKIP ［J］.Nature，1999，401(6749):173-177.

［3］Yeung K，Janosch P，McFerran B，et al.Mechanism of suppression of the Raf/MEK/extracellular signal-regulated kinase pathway by the raf kinase inhibitor protein ［J］.Mol Cell Biol，2000，20(9):3079-3085.

［4］Yeung KC，Rose DW，Dhillon AS，et al.Raf kinase inhibitor protein interacts with NF-kappaB-inducing kinase and TAK1 and inhibits NF-kappaB activation ［J］.Mol Cell Biol，2001，21(21):7207-7217.

［5］Fu Z，Smith PC，Zhang L，et al.Effects of raf kinase inhibitor protein expression on suppression of prostate cancer metastasis［J］.J Natl Cancer Inst，2003，95(12):878-889.

［6］Keller ET，F(xiàn)u Z，Brennan M.The biology of a prostate cancer metastasis suppressor protein:Raf kinase inhibitor protein［J］.J Cell Biochem，2005，94(2):273-278.

［7］Minoo P，Zlobec I，Baker K，et al.Loss of raf-1 kinase inhibitor protein expression is associated with tumor progression and metastasis in colorectal cancer［J］.Am J Clin Pathol，2007，127(5):820-827.

［8］Al-Mulla F，Behbehani AI，Bitar MS，et al.Genetic profiling of stageⅠandⅡcolorectal cancer may predict metastatic relapse［J］.Mod Pathol，2006，19(5):648-658.

［9］Shabani HK，Kitange G，Tsunoda K，et al.Immunohistochemical expression of E-cadherin in metastatic brain tumors［J］.Brain Tumor Pathol，2003，20(1):7-12.

［10］Hirohashi S.Inactivation of the E-cadherin-mediated cell adhesion system in human cancers［J］.Am J Pathol，1998，153(2):333-339.

［11］陸身修，鐘狂飚，朱利勇，等.RKIP和E-cadherin在前列腺癌組織中的表達(dá)［J］.中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2009，34(9):892-897.

［12］Shin SY，Rath O，Zebisch A，et al.Functional roles of multiple feedback loops in extracellular signal-regulated kinase and Wnt signaling pathways that regulate epithelial-mesenchymal transition［J］.Cancer Res，2010，70(17):6715-6724.

［13］Janda E，Nevolo M，Lehmann K，et al.Raf plus TGFbeta-dependent EMT is initiated by endocytosis and lysosomal degradation of E-cadherin［J］.Oncogene，2006，25(54):7117-7130.