56例疑診顱內(nèi)感染患者腦脊液中病原菌的基因芯片技術(shù)檢測結(jié)果

丁錦榮，管義祥，吳德模，張春秀

(1南通大學(xué)附屬海安醫(yī)院，江蘇南通226600;2生物芯片上海國家工程研究中心研發(fā)部)

目前，顱內(nèi)細菌感染的診斷主要依靠腦脊液細菌培養(yǎng)，但細菌培養(yǎng)周期長，且細菌極易受環(huán)境影響，出現(xiàn)標(biāo)本污染、細菌壞死等可能。單純依靠腦脊液細菌培養(yǎng)進行致病菌的鑒定明顯滯后于臨床治療［1］?；蛐酒夹g(shù)是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一項新型生物技術(shù)，具有快速、高效、敏感度及準(zhǔn)確性高、操作簡單等優(yōu)點，能同時對常見致病菌特異性的DNA 進行檢測［2，3］。2010年1月～2013年6月，我們選擇顱內(nèi)感染常見致病菌的DNA特異序列設(shè)計并制作復(fù)合基因芯片，用于56例疑診顱內(nèi)感染患者腦脊液中病原菌的檢測?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 疑診顱內(nèi)感染患者56例，男40例，女16例;年齡23～72(46.8±12.8)歲。顱內(nèi)感染的臨床診斷參照Harrison標(biāo)準(zhǔn)［4］及神經(jīng)外科特點［5］，其中腦脊液鼻漏患者2例，開放性腦外傷患者8例，手術(shù)時間超過4 h者26例，2次手術(shù)患者18例，腦出血腦室引流術(shù)后患者2例。臨床表現(xiàn)為高熱48例，腦膜刺激征32例，顱內(nèi)高壓18例，所有病例腦脊液常規(guī)檢查均提示W(wǎng)BC＞1.18×109/L。

1.2 主要儀器及試劑 PMC-082芯片離心機，OmniGridTM100微陣列點樣器，分子雜交箱，GenPix 400B共聚焦激光掃描儀，GenPix Pro 6.0圖像掃描和分析軟件，DNeasy Blood＆Tissue Kit，光學(xué)級醛基化修飾芯片。

1.3 腦脊液標(biāo)本采集 嚴(yán)格無菌操作下腰穿留取腦脊液標(biāo)本，其中送腦脊液培養(yǎng)留取5～8 mL，送基因芯片檢測腦脊液標(biāo)本約2 mL。為避免標(biāo)本污染及細菌凋亡或壞死，所送腦脊液標(biāo)本要求在1 h內(nèi)送檢。

1.4 腦脊液細菌培養(yǎng) 應(yīng)用接種環(huán)挑取腦脊液樣本并接種于血瓊脂平板及巧克力瓊脂平板上，于35℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h后涂片檢查，觀察菌群形態(tài)，鑒定細菌種類。

1.5 基因芯片技術(shù)應(yīng)用方法 取約2 mL腦脊液標(biāo)本在離心機中以8 000 r/min離心10 min，棄上清;加等量滅菌生理鹽水充分震蕩，懸浮沉淀后再次以8 000 r/min離心10 min，棄上清;加入DNA裂解液180 μL，充分震蕩混勻，于37℃溫浴30 min;加入25 μL 蛋白酶 K，56 ℃ 下溫浴 30 min;加入 200 μL乙醇，采用離心柱提取腦脊液細菌DNA。在Genbank數(shù)據(jù)庫中篩選出4種顱內(nèi)感染常見細菌［金黃色葡萄球菌(SA)、肺炎克雷伯菌(KNP)、大腸桿菌(E.coli)、肺炎雙球菌(PC)］的特異DNA序列及靶序列。用 Primer Premier 5.0軟件設(shè)計出菌株的PCR引物，同時選擇所有細菌共有的16S基因設(shè)計引物和探針作為陽性對照。將提取的DNA用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)擴增，在反應(yīng)底物中加入一定濃度的Cy3-dUTP熒光標(biāo)志物，使其混入聚合酶鏈反應(yīng)擴增產(chǎn)物中，作為雜交后激光掃描儀掃描檢測的標(biāo)記。擴增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳及結(jié)果判定(2%瓊脂糖，150 V，電泳時間15 min)。結(jié)果可見相應(yīng)的清晰條帶(圖1)，設(shè)計的引物序列特異、有效。進行基片的活化處理，將合成的Oligo(探針)用點樣液稀釋至濃度50 mmol/L，并放入 384孔板中，每孔 10 μL。用點樣儀點樣探針于活化的基片上，點樣矩陣為6×6，各點隨機排列，每個探針位點重復(fù)4次(表1)。點樣后將芯片固定、洗凈，并離心甩干，置于干燥箱中保存?zhèn)溆?。?8℃下將備用的Cy3熒光標(biāo)記聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物與雜交液按1∶2比例離心機下混勻后的混合液進行熱變性2 h，冰浴驟冷后，加樣于芯片上的點樣區(qū)。封片后在42℃下水浴雜交2～3 h，雜交結(jié)束后清洗甩干，應(yīng)用GenPix 400B共聚焦激光掃描儀進行掃描(波長532 nm)。用GenPix Pro 6.0圖像掃描和分析軟件提取每個探針位點的熒光信號強度值，去除低信號位點，高于cut off值(SNR=3.0)的探針信號為有效信號。

圖1 常見顱內(nèi)感染細菌基因檢測的PCR產(chǎn)物電泳圖

表1 細菌基因檢測芯片排布圖

2 結(jié)果

聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物與特異性探針雜交后，在基因芯片上相應(yīng)的位點顯示出綠色熒光，從而鑒定出相應(yīng)的細菌種類(圖2)。

圖2 基因芯片鑒定菌種

56例實驗標(biāo)本中，經(jīng)腦脊液細菌培養(yǎng)確診顱內(nèi)感染18例，診斷陽性率為32.14%，病原菌為金黃色葡萄糖球菌6例，肺炎克雷伯菌3例，大腸桿菌2例，肺炎雙球菌2例，鮑曼不動桿菌2例，銅綠假單胞菌2例，耳葡萄糖球菌1例;基因芯片技術(shù)確診顱內(nèi)感染38例，診斷陽性率為39.29%，明確顱內(nèi)感染致病菌22例，其中金黃色葡萄糖球菌8例，肺炎克雷伯菌5例，大腸桿菌5例，肺炎雙球菌4例，與腦脊液細菌培養(yǎng)陽性標(biāo)本結(jié)果完全符合;16例未能鑒定出致病菌，但檢出16S基因。

3 討論

腦脊液細菌培養(yǎng)以其高特異性作為顱內(nèi)感染的診斷金標(biāo)準(zhǔn)。但腦脊液細菌培養(yǎng)所需時間長(常需2～3個工作日，如果為霉菌、結(jié)核桿菌，則時間更長［6］)，且容易受到各種因素干擾，存在諸多不足，比如肺炎雙球菌，雖是顱內(nèi)細菌感染常見菌，但因其對營養(yǎng)的要求高，送檢過程中容易出現(xiàn)細菌壞死或凋亡，以致培養(yǎng)陽性率很低。

基因芯片技術(shù)操作簡單，檢測迅捷，其所用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)對標(biāo)本中細菌要求低，即使菌落數(shù)很少，細菌已壞死或凋亡，只要標(biāo)本中含有微量的目的DNA，甚至于只要存在部分降解的DNA序列，也可通過聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)實施樣本的擴增，從而檢測出相應(yīng)的致病菌［7，8］?；蛐酒夹g(shù)發(fā)展有以下趨勢:①基因芯片的高密度化，將更多致病菌的特異DNA序列加入基因芯片中，使得探針的效率提高，同一張基因芯片可以更高效的同時探測更多種類的致病菌;②基因芯片的商品化［9］，隨著臨床需求的增多，更多的基因芯片生產(chǎn)廠家加入到顱內(nèi)感染致病菌基因芯片的制備中，將會有更多商品化的顱內(nèi)感染細菌基因檢測試劑盒問世，在基因芯片小型化，所需樣本微量化上一定會取得長足的進展，將會大大降低目前基因檢測的成本，提高檢測的靈敏度，促進基因芯片技術(shù)在臨床快速診斷顱內(nèi)細菌感染中的應(yīng)用。

本研究中38例經(jīng)基因芯片技術(shù)確診顱內(nèi)感染病例中有16例未能鑒定出致病菌，但仍檢出16S基因，其原因在于我們所制備的聚合酶鏈反應(yīng)底物不包括這些致病菌的特異性DNA序列，但這些細菌仍保留著16S rDNA基因。有20例腦脊液標(biāo)本未能培養(yǎng)出致病菌，而基因芯片技術(shù)鑒定出菌種，而這些病例均有著明顯的顱內(nèi)感染征象，考慮以下可能:①顱內(nèi)感染早期，腦脊液中細菌含量低，而目前細菌培養(yǎng)所用的乳膠凝集實驗對最低菌落數(shù)有最低要求［10］，要提高陽性率就需要更多的檢測樣本;②目前臨床早期經(jīng)驗型抗生素的治療一定程度上降低了腦脊液培養(yǎng)的陽性率。另有18例臨床診斷為顱內(nèi)感染，但未能通過基因芯片技術(shù)證實致病菌的存在?？赡茉?①部分樣本的DNA含量過低，雖經(jīng)多次擴增，仍未獲得熒光標(biāo)記所需要的最少DNA量;②實驗所用熒光標(biāo)記法自身存在敏感度不高的缺陷;③臨床存在一定量的假性腦膜炎病例，雖有顱內(nèi)感染表現(xiàn)，但無感染病原菌的存在。

本研究選取4種常見顱內(nèi)感染致病菌的特異DNA序列制作復(fù)合基因芯片，通過基因芯片技術(shù)，1 d內(nèi)完成了對可疑腦脊液標(biāo)本的檢測，檢測結(jié)果與腦脊液細菌培養(yǎng)一致，而且檢測出腦脊液培養(yǎng)陰性的顱內(nèi)細菌感染［11］。可見，基因芯片技術(shù)對顱內(nèi)感染的診斷陽性率及金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、肺炎雙球菌的檢出率高于細菌培養(yǎng)，值得借鑒。

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