頸動(dòng)脈斑塊破裂動(dòng)物模型的建立

韓學(xué)府，王麗麗，王 健，陳 茜，楊 笛

(1濰坊市人民醫(yī)院，山東濰坊261000;2南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是心腦血管疾病的發(fā)病基礎(chǔ)。臨床上各種急癥多是由易損斑塊發(fā)生破裂及血栓形成，部分或完全阻塞管腔引起相應(yīng)器官缺血壞死所致，但尚不明確導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定及破裂的確切機(jī)制。載脂蛋白E(ApoE)缺陷小鼠普通飲食即可自發(fā)高脂血癥［1，2］。大量研究［3～5］報(bào)道了 ApoE 缺陷小鼠各級(jí)動(dòng)脈斑塊病變的過程，病變中包含大量脂質(zhì)、泡沫細(xì)胞和動(dòng)脈內(nèi)膜增生等，但很少觀察到斑塊破裂。已有的小鼠斑塊破裂模型由于實(shí)驗(yàn)周期長，重復(fù)性差，斑塊破裂率低等原因引起廣泛的爭議。目前尚沒有一種公認(rèn)的斑塊破裂模型。有研究者［6，7］通過在ApoE缺陷小鼠左側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎并套管誘發(fā)了明顯的斑塊破裂，創(chuàng)造出一種新的動(dòng)脈斑塊破裂模型。該模型由于簡便、快速、重復(fù)性好、斑塊破裂率高等優(yōu)點(diǎn)大大改善了以往模型的弊端。本研究建立了ApoE缺陷小鼠頸動(dòng)脈斑塊破裂模型，并初步探討該模型意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡、雄性、ApoE缺陷小鼠36只，購自北京大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心，SPF級(jí)，合格證號(hào)為SCXK(京)2006-0008，普通飲食。

1.2 試劑與儀器 兔抗小鼠vWF一抗(abcam，1∶800)、兔抗小鼠 αSMC-actin 一抗(abcam，1∶100)、生物素標(biāo)記山羊抗兔二抗(Vector Laboratories，1∶200)、R.T.U.ABC kit(Vector Laboratories，1∶200)、DAB 顯色液(Vector Laboratories，SK-4100)。雙目體式顯微鏡(南京江南永新光學(xué)有限公司)、熒光顯微鏡(Carl Zeiss，Inc)。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 36只ApoE缺陷小鼠隨機(jī)分為6組:未結(jié)扎組、單純結(jié)扎組、結(jié)扎套管2天組、結(jié)扎套管4天組、結(jié)扎套管7天組和假手術(shù)組(套管后即取下)，各6只。實(shí)驗(yàn)在濰坊醫(yī)學(xué)院動(dòng)物飼養(yǎng)中心SPF級(jí)環(huán)境中進(jìn)行。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)規(guī)章制度。

1.3.2 小鼠斑塊破裂模型的制作 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后9周齡時(shí)開始實(shí)驗(yàn)。未結(jié)扎組繼續(xù)普通飲食4周，其他組小鼠用7.5%水合氯醛(0.1 mL/20 g，4 ℃避光保存)麻醉固定，體式鏡下沿頸部正中做一長約1 cm矢狀切口，逐層剝離組織，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，注意勿傷及迷走神經(jīng)和靜脈。用絲線在頸總動(dòng)脈分叉處近端結(jié)扎血管，完全阻斷血流，逐層縫合組織，普通小鼠飼料喂養(yǎng)4周，飲水不限。4周后，未結(jié)扎組與單純結(jié)扎組小鼠麻醉取材，套管各組和假手術(shù)組小鼠再次分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，并于結(jié)扎處近端置一聚乙烯管(長度2 mm，外徑0.965 mm，內(nèi)徑0.580 mm，BD Biosciences)，絲線固定套管，縫合組織。結(jié)扎套管2天組、結(jié)扎套管4天組、結(jié)扎套管7天組分別于套管后的第2天、第4天和第7天取材。假手術(shù)組小鼠套管后即刻取下套管，術(shù)后2周取材。

1.3.3 觀察方法 動(dòng)脈取材后，冷PBS清洗，浸入4%多聚甲醛固定。制作石蠟切片，行連續(xù)切片，每隔60 μm切片行HE染色和Masson染色，免疫組織化學(xué)觀察管腔斑塊內(nèi)α肌動(dòng)蛋白(αSMC-actin)和血管性血友病因子(vWF)的表達(dá)狀況。用HE染色切片觀察所有小鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)斑塊形態(tài)，使用Photoshop 7.0和Image Pro Plus 6.0研究頸總動(dòng)脈結(jié)扎、套管前后管腔狹窄程度(管腔狹窄率為新生內(nèi)膜面積占管腔面積的百分?jǐn)?shù))、中膜厚度(內(nèi)外彈力膜間垂直距離，分別于血管 0、2、4、6、8、10 點(diǎn)方向處測(cè)量，取其均值)、單位中膜面積細(xì)胞數(shù)(內(nèi)外彈力膜間細(xì)胞數(shù)，以細(xì)胞核數(shù)為準(zhǔn))和斑塊內(nèi)膠原含量的變化。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。未結(jié)扎組與單純結(jié)扎組小鼠管腔狹窄程度、中膜厚度和單位中膜面積細(xì)胞數(shù)數(shù)據(jù)采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);單純結(jié)扎組與套管各組管腔狹窄程度、中膜厚度、膠原含量和單位中膜面積細(xì)胞數(shù)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

未結(jié)扎組、單純結(jié)扎組管腔狹窄率分別為0.10% ±0.018%、0.88% ±0.033%，中膜厚度分別為(0.44 ±0.02)、(0.70 ±0.04)mm，單位中膜面積細(xì)胞數(shù)分別為(16.5 ±1.03)、(12.7 ±1.07)個(gè)，兩組比較，P均＜0.05。單純結(jié)扎組小鼠自結(jié)扎動(dòng)脈遠(yuǎn)端至近端血管可見管腔內(nèi)膜增生明顯，管腔狹窄，斑塊內(nèi)散在分布大量泡沫細(xì)胞，斑塊表面可見明顯纖維帽形成(圖1)。單純結(jié)扎組、結(jié)扎套管2天組、結(jié)扎套管4天組、結(jié)扎套管7天組和假手術(shù)組斑塊破裂分別為0、5、4、6、0只。未結(jié)扎組管壁內(nèi)無膠原表達(dá)，其他各組斑塊內(nèi)及斑塊破裂處均有膠原表達(dá)，但斑塊破裂后膠原明顯較少。單純結(jié)扎組、結(jié)扎套管2天組、結(jié)扎套管4天組、結(jié)扎套管7天組和假手術(shù)組單位斑塊面積內(nèi)膠原含量分別為0.47±0.04、0.09 ±0.03、0.12 ±0.04、0.16 ±0.08、0.41 ±0.07，單純結(jié)扎組與假手術(shù)組比較，P＞0.05，單純結(jié)扎組與套管各組比較，P均＜0.05。單純結(jié)扎組動(dòng)脈斑塊內(nèi)部和纖維帽處均可檢測(cè)到αSMC-actin表達(dá)，但纖維帽處表達(dá)更明顯;斑塊破裂后局部仍有表達(dá)，但纖維帽處表達(dá)減弱。vWF在部分斑塊內(nèi)表達(dá)，在斑塊破裂處無表達(dá)(圖2)。

圖1 單純結(jié)扎組結(jié)扎動(dòng)脈血管HE染色(×400)

圖2 破裂斑塊αSMC-actin、vWF免疫組織化學(xué)染色

3 討論

正常ApoE缺陷小鼠普通飲食4周后血管內(nèi)膜光滑平整，中膜僅由3～4層彈力膜及平滑肌細(xì)胞組成，外膜細(xì)胞成分少。動(dòng)脈結(jié)扎4周后，管腔內(nèi)出現(xiàn)了明顯的富含膠原的新生內(nèi)膜，該內(nèi)膜中伴有泡沫細(xì)胞聚集和纖維帽形成，通過免疫組織化學(xué)方法于斑塊內(nèi)可檢測(cè)到αSMC-actin及vWF因子的表達(dá)，行Masson染色于斑塊內(nèi)檢測(cè)到膠原蛋白表達(dá)?？梢姡覀兺ㄟ^結(jié)扎小鼠頸總動(dòng)脈，并飼以普通飲食，在其管腔內(nèi)形成了富含膠原、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、泡沫細(xì)胞的斑塊，雖然該斑塊與人類斑塊形態(tài)上仍有差異，但該新生內(nèi)膜中包含了纖維帽、脂質(zhì)池等斑塊的基本特征［8，9］。因此，該新生內(nèi)膜可稱其為斑塊。4周后通過血管外置管來誘發(fā)斑塊破裂。套管后2、4和7 d均出現(xiàn)了斑塊破裂，但套管7 d后全部小鼠斑塊均發(fā)生破裂。15只ApoE缺陷小鼠套管后發(fā)生斑塊破裂，其中發(fā)生破裂伴斑塊內(nèi)出血10(66.7%)只，發(fā)生破裂伴管腔內(nèi)血栓形成4(26.7%)只，發(fā)生斑塊脫落1(6.7%)只，提示本模型小鼠斑塊破裂的主要表現(xiàn)是斑塊破裂伴出血。假手術(shù)組小鼠均未出現(xiàn)斑塊破裂，提示手術(shù)操作過程不會(huì)對(duì)斑塊破裂造成影響。

單純結(jié)扎組較未結(jié)扎組管腔狹窄、管壁增厚、管壁單位面積細(xì)胞數(shù)減少，均提示結(jié)扎促使了血管發(fā)生病理性重塑。vWF僅在正常血管內(nèi)有表達(dá)，結(jié)扎和套管后血管管腔內(nèi)均未見表達(dá)，而在部分斑塊內(nèi)出現(xiàn)表達(dá)，提示在該模型小鼠斑塊內(nèi)并發(fā)新生血管的形成，而此可導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定，容易發(fā)生破裂。大量的αSMC-actin細(xì)胞彌漫性分布于斑塊內(nèi)，而在管壁中的表達(dá)減弱甚至消失，而且在管壁內(nèi)彈力膜斷裂處可見細(xì)胞發(fā)生遷移，均提示中膜平滑肌細(xì)胞可能遷移至管腔參與了斑塊的形成。有研究者［10，11］分別證明結(jié)扎ApoE缺陷小鼠頸總動(dòng)脈后管腔內(nèi)形成的斑塊內(nèi)富含平滑肌和巨噬細(xì)胞。套管后促使斑塊發(fā)生破裂，破裂斑塊纖維帽處αSMC-actin表達(dá)減弱，同時(shí)斑塊內(nèi)膠原含量也減少，提示平滑肌細(xì)胞的減少和膠原含量的下降可能為導(dǎo)致斑塊破裂的機(jī)制之一。

已有的ApoE缺陷小鼠斑塊破裂模型采用長時(shí)間(42～54周)普通飲食飼養(yǎng)［5］，或飼以高脂飲食2個(gè)月［12］誘發(fā)頭臂干動(dòng)脈不穩(wěn)定斑塊形成，或通過血管外套管誘發(fā)動(dòng)脈斑塊形成，后轉(zhuǎn)入p53蛋白，加用血管收縮劑促進(jìn)斑塊破裂［13，14］或利用血流動(dòng)力學(xué)在低剪切力區(qū)形成不穩(wěn)定斑塊，加用血管收縮劑誘發(fā)破裂［15］等方法，但這些模型存在實(shí)驗(yàn)周期長，重復(fù)性差、斑塊破裂率低等問題。與這些模型相比，該模型具有簡便，快速，斑塊破裂率高，重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì)。該動(dòng)物模型也有自己的缺陷和不足，如斑塊是由血管損傷后誘發(fā)形成，形態(tài)上并非典型的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，斑塊內(nèi)脂質(zhì)成分少，膠原分布彌漫，斑塊內(nèi)未見鈣化等。套管后斑塊內(nèi)多處出現(xiàn)出血，但并未見明顯的破裂口，斑塊內(nèi)出血可能由斑塊內(nèi)新生血管形成所致。因此，該模型小鼠斑塊破裂的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。我們通過結(jié)扎頸總動(dòng)脈在管腔內(nèi)產(chǎn)生了富含平滑肌細(xì)胞、泡沫細(xì)胞和膠原的斑塊，通過套管誘發(fā)了斑塊破裂、出血及血栓形成。雖然該模型斑塊破裂的機(jī)制有待進(jìn)一步研究，但該模型小鼠為在體研究致斑塊破裂因素提供了良好的平臺(tái)。

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