結(jié)腸癌組織中Ku70、轉(zhuǎn)錄因子Sp1的表達(dá)變化及意義

胡 楠，鄭義同，吳風(fēng)雷

(連云港市第一人民醫(yī)院，江蘇連云港222002)

Ku70是完成DNA雙鏈斷裂修復(fù)途徑關(guān)鍵成分DNA依賴蛋白激酶(DNA-PK)的重要組成部分［1］。近年來，由于對(duì)DNA修復(fù)系統(tǒng)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)注，Ku70作為重要的DNA修復(fù)因子成為研究熱點(diǎn)。研究者們通過多種實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)了Ku70在人體不同組織中的分布，發(fā)現(xiàn)在正常組織向腫瘤進(jìn)展過程中，組織細(xì)胞中Ku70表達(dá)各異。目前Ku70在消化道腫瘤方面的研究較少。特異性蛋白1(Sp1)是一個(gè)序列特異的DNA結(jié)合蛋白，在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長、分化、轉(zhuǎn)移及血管生成過程中起重要作用［2，3］。研究發(fā)現(xiàn)，Sp1在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可能是一個(gè)新的生物學(xué)標(biāo)志，然而Sp1表達(dá)與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展及作用機(jī)制尚不清楚。本研究分別采用免疫組化SP法、RT-PCR法檢測(cè)結(jié)腸癌及癌旁正常組織中Ku70和Sp1蛋白及mRNA，觀察兩指標(biāo)的表達(dá)變化，探討二者的相關(guān)性。旨在更好地了解Ku70、Sp1基因?qū)Y(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的影響，以便發(fā)現(xiàn)新的腫瘤靶向治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2012年10月～2014年6月連云港市第一人民醫(yī)院收治的結(jié)腸癌患者61例，男32例，女29例;年齡(65±9)歲。術(shù)前均未接受放、化療治療。手術(shù)切除結(jié)腸癌組織及距腫瘤邊緣5 cm以外的正常結(jié)腸黏膜組織。病理檢查證實(shí)均為腺癌;其中高分化15例，中分化33例，低分化13例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者39例。組織標(biāo)本于-80℃液氮保存，用10%甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，5 μm連續(xù)石蠟切片。

1.2 試劑 TRIzol總RNA提取試劑盒購自Invitrigen公司。SABC(Strept Avidin-Biotin Complex)免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒、兔抗人Ku70、Sp1單 克隆抗體購自武漢博士德公司。

1.3 Ku70、Sp1蛋白的檢測(cè)方法 采用免疫組化SP法。染色步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。Ku70、Sp1工作液濃度分別以1∶200，1∶150稀釋，用 PBS替代一抗做陰性對(duì)照。染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn):無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。同樣物鏡下陽性細(xì)胞百分比≤10%為1分、11%～50%為2分、51%～75%為3分、＞75%為4分。上述兩類分?jǐn)?shù)的乘積≥3為陽性。

1.4 Ku70、Sp1 mRNA的檢測(cè)方法 采用RT-PCR法。總RNA提取和RT-PCR擴(kuò)增分別按TRIzol試劑盒說明進(jìn)行。Ku70和Sp1的PCR引物序列由上海博亞生物公司合成，Ku70基因上游引物:5'-GGGTCTGTGCCAACCTCTTTA-3';下游引物:5'-CAGCTTTAACCTGCTGAGTGC-3'，擴(kuò)增長度341 bp;Sp1上游引物:5'-TGGTGGGCAGTATGTTGT-3'，下 游 引 物:5'-GCTATTGGCATTGGTGAA-3'，擴(kuò)增長度550 bp;內(nèi)對(duì)照β-actin上游引物:5'-CGGGAAATCGTGCGTGACATT-3'，下游引物:5'-CGTCAGGCAGCTCGTAGCTCTT-3'，擴(kuò)增長度118 bp。RT-PCR反應(yīng)條件為:70℃、5 min，冰浴 10 min，42 ℃、60 min，95 ℃、5 min，冰浴，以 94℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，循環(huán)30 個(gè)周期后72℃延伸10 min。將產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，每次上樣量均為6 μL，在紫外燈上觀察電泳結(jié)果，用Syngene凝膠成像分析系統(tǒng)分析。計(jì)算所得產(chǎn)物的積分吸光度與各自內(nèi)參照積分吸光度的比值，觀察該基因mRNA的表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，兩組比較用t檢驗(yàn)率的比較用χ2檢驗(yàn)，采用Spearman等級(jí)相關(guān)法分析Ku70、Sp1間的關(guān)系。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

Ku70蛋白主要著色于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，結(jié)腸癌組織與癌旁正常組織中Ku70陽性表達(dá)率分別為68.9%(42/61)、36.1%(22/61)，兩者比較，P ＜0.05(χ2=13.1)。Sp1 蛋白主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)及胞核中表達(dá)，結(jié)腸癌癌組織與癌旁正常組織中Sp1 陽性表達(dá)率分別為 78.7%(48/61)、26.2%(16/61)，兩者比較，P ＜0.05(χ2=33.7)。結(jié)腸癌和癌旁正常組織中Ku70 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.184 ± 0.410、0.845 ± 0.424，兩者比較，P ＜0.05(t=1.897)，Sp1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量分別為1.280 ±0.311、0.912 ±0.362，兩者比較，P ＜0.05(t=2.097)，見圖1。Ku70 mRNA 和 Sp1 mRNA 在結(jié)腸癌組織中表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.398，P=0.029)。Sp1和Ku70蛋白表達(dá)均與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表1。Sp1、Ku70蛋白表達(dá)與結(jié)腸癌腫瘤直徑、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)(P均＜0.05)。

圖1 Ku70 mRNA、Sp1 mRNA在癌旁正常組織和結(jié)腸癌中的表達(dá)

3 討論

Ku70最早發(fā)現(xiàn)于多發(fā)性肌炎綜合征患者自身抗原，是完成DNA雙鏈斷裂修復(fù)途徑關(guān)鍵成分DNA-PK的重要組成部分，在諸多腫瘤組織中呈高表達(dá)，且在不同腫瘤進(jìn)展過程中Ku70表達(dá)各異［4，5］。Economopoulou 等［6］通過Western blotting方法檢測(cè)了Ku70在成人骨髓異常增生綜合征中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，核型預(yù)后較好的患者Ku70表達(dá)率低。另有研究［7］發(fā)現(xiàn)，不同腫瘤組織中Ku70表達(dá)與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中Ku70表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，這一結(jié)果與Mazzarelli等［8］研究一致。

表1 Sp1和Ku70蛋白表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

轉(zhuǎn)錄因子是一種具有DNA結(jié)合序列的特殊蛋白［9～11］，可與誘導(dǎo)細(xì)胞增強(qiáng)元件相互作用，通過開啟、關(guān)閉、增強(qiáng)或減弱等控制靶基因有選擇的表達(dá)［10，11］。Sp1 是 Sp1/Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，是該家族中最早鑒定且功能研究較廣泛的蛋白，通過與基因啟動(dòng)子區(qū)的GC盒結(jié)合以及其他蛋白質(zhì)相互作用的核轉(zhuǎn)錄因子，與許多靶基因的啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄有關(guān)，在細(xì)胞增殖、凋亡、分化和腫瘤形成等過程中起重要作用［14，15］。Zhao 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，通過干擾RNA沉默Sp1表達(dá)，可抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞的生長并促進(jìn)其凋亡。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中Sp1表達(dá)明顯升高，提示Sp1參與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過程，并可能作為患者預(yù)后評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。

目前，導(dǎo)致Sp1過度活化的機(jī)制尚不清楚，Sp1蛋白的修飾降解可直接調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性。在轉(zhuǎn)錄水平上，Ku70基因與Sp1轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物，已有研究證實(shí)Ku70基因的近端啟動(dòng)子區(qū)富含GC序列，其中“GGCGGG”序列是轉(zhuǎn)錄因子Sp1的順式作用元件。Sp1與之結(jié)合后，與RNA聚合酶等共同構(gòu)成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，促進(jìn)Ku70的轉(zhuǎn)錄［17］。本研究結(jié)果顯示，Sp1與Ku70表達(dá)呈正相關(guān)，可能由于Ku70啟動(dòng)子區(qū)富含GC盒，是典型的TATA-Less啟動(dòng)子，在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游存在多個(gè)反式作用因子Sp1結(jié)合點(diǎn)［17］，促進(jìn)Ku70基因的轉(zhuǎn)錄。本研究結(jié)果提示二者的表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展及惡性程度及腫瘤轉(zhuǎn)移有一定關(guān)系，Sp1與Ku70表達(dá)的一致性較好，隨著腫瘤的發(fā)生發(fā)展、惡性程度的增高，Sp1與Ku70表達(dá)均明顯增強(qiáng)。正常細(xì)胞調(diào)控機(jī)制下二者可使受損細(xì)胞的DNA修復(fù)，防止細(xì)胞癌變，其活性的增強(qiáng)則可能為腫瘤細(xì)胞無限增殖，同時(shí)抑制了正常細(xì)胞DNA自發(fā)損傷的修復(fù)，促使腫瘤細(xì)胞的DNA修復(fù)，進(jìn)而降低了放化療的敏感性。

由此可見，Ku70和Sp1在結(jié)腸癌中高表達(dá)，與結(jié)腸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)，二者可作為結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的預(yù)測(cè)指標(biāo)。對(duì)Sp1與Ku70基因的深入研究有可能使其作為結(jié)腸腫瘤惡變的標(biāo)志物，在腫瘤預(yù)防、診斷及治療等方面提供重要的理論依據(jù)，但Sp1與Ku70在結(jié)腸腫瘤組織發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移中的具體調(diào)控機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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