基底細(xì)胞樣乳腺癌組織中Apaf-1、Caspase-9的表達(dá)變化及意義

張丙信，趙 霞，陳 雪，周炳娟，趙文明，李金梅，孫吉瑞，張金庫

(保定市第一中心醫(yī)院，河北保定071000)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年新發(fā)病例近百萬，嚴(yán)重威脅女性健康［1］?；准?xì)胞樣乳腺癌(BLBC)是乳腺癌的一個(gè)亞型，其組織病理學(xué)、臨床表現(xiàn)及免疫表型均具特征性，且具有較高的增殖指數(shù)和預(yù)后不良的生物學(xué)行為。近年通過對(duì)細(xì)胞凋亡的研究，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞凋亡失控與腫瘤組織的生長關(guān)系密切。因此，研究BLBC細(xì)胞的凋亡對(duì)于了解BLBC的發(fā)生、發(fā)展有重要的意義。本研究采用免疫組法對(duì)BLBC組織中與細(xì)胞凋亡有關(guān)的 Apaf-1、Caspase-9蛋白進(jìn)行檢測(cè)，初步探討Apaf-1和Caspase-9在BLBC發(fā)生、發(fā)展中所起的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2006年1月～2013年12月我院收治的BLBC患者43例(A組)，均為女性;年齡24～69歲，中位年齡56歲，其中＜50歲27例，≥50歲16例;所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放療、化療及內(nèi)分泌治療。手術(shù)留取BLBC組織標(biāo)本43例份，標(biāo)本均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)。腫瘤直徑＜2 cm者25例，≥2 cm者18例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例;臨床分期Ⅰ～Ⅱ期16例，Ⅲ～Ⅳ期27例。非基底細(xì)胞樣乳腺癌標(biāo)本57例份(B組)，患者均為女性;年齡25～84歲，中位年齡49歲。另取距BLBC邊緣5 cm的正常乳腺組織60例份(C組)，患者均為女性;年齡25～63歲，中位年齡42歲。

1.2 試劑 兔抗人Apaf-1和Caspase-9多克隆抗體購自Affinity Biosciences公司，工作液濃度1∶100，ER、PR、C-erbB-2、CK5/6(MAB-0276)、表皮生長因子受體、即用型快捷免疫組化MaxVision檢測(cè)試劑盒(KIT-5020)和氨基聯(lián)苯胺(DAB-0031)顯色試劑盒均購自福州邁新生物公司。

1.3 Apaf-1、Caspase-9的檢測(cè) 采用免疫組化二步法。標(biāo)本常規(guī)取材，4%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。操作步驟均按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行，采用檸檬酸修復(fù)液(pH6.0)高溫高壓修復(fù)抗原，以Apaf-1、Caspase-9陽性的胃組織作為陽性對(duì)照，以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):Apaf-1、Caspase-9在陽性反應(yīng)為在細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)明確棕黃色顆粒。結(jié)果由兩位資深病理醫(yī)師采用盲法以每張切片在200倍鏡下觀察整體染色情況，隨機(jī)讀取100個(gè)細(xì)胞。陽性細(xì)胞率=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。切片中陽性細(xì)胞率≥5%為陽性病例，＜5%為陰性病例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。Apaf-1和Caspase-9的表達(dá)及其與BLBC的臨床病理因素的分析采用 χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組 Apaf-1、Caspase-9表達(dá)比較 A、B、C組Apaf-1 陽性率分別為 23.3%(10/43)、49.1%(28/57)、75%(45/60)，兩兩比較，P 均 ＜0.01;Caspase-9 陽性率分別為 27.9%(12/43)、54.4%(31/57)、85%(51/60)，兩兩比較，P 均 ＜0.01。

2.2 Apaf-1、Caspase-9表達(dá)與BLBC臨床病理參數(shù)的關(guān)系 結(jié)果見表1。由表1可知，Apaf-1表達(dá)與BLBC腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)(P均＜0.05)，Caspase-9表達(dá)與 BLBC 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)(P均＜0.05)。

表1 Apaf-1、Caspase-9表達(dá)與BLBC臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 BLBC組織Apaf-1與Caspase-9陽性表達(dá)的關(guān)系 Spearman相關(guān)分析顯示，BLBC組織Apaf-1與Caspase-9 陽性表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.639，P ＜0.01)。

3 討論

BLBC是從分子角度上定義，強(qiáng)調(diào)具有基底細(xì)胞基因表型，且表達(dá)基底細(xì)胞角蛋白與肌上皮標(biāo)志物的一種特殊類型的乳腺癌。2003年Sorlie等［2］對(duì)乳腺癌進(jìn)行基因分析，將乳腺癌分為5種亞型，即管腔A型、管腔B型、正常乳腺樣型、HER-2過表達(dá)型及基底細(xì)胞樣型，并指出這些亞型在生物學(xué)特性上是完全獨(dú)立的，其中BLBC的基因表達(dá)獨(dú)特，預(yù)后較一般浸潤性乳腺癌差，具有重要的臨床病理意義。目前，為大部分學(xué)者所接受的BLBC免疫表型為在“三聯(lián)陰性”(即ER、PR、HER-2均呈陰性)的基礎(chǔ)上，同時(shí)表達(dá)一種或一種以上的基底細(xì)胞型角蛋白(如 CK5/6、CK14 等)和(或)EGFR。據(jù)文獻(xiàn)［3］報(bào)道，BLBC占全部乳腺癌的8%～20%。在相關(guān)的幾項(xiàng)研究中，BLBC 平均發(fā)病年齡為 47～55歲［4～6］。但目前國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道尚有差異，尚待進(jìn)一步研究。BLBC通常呈浸潤性生長，多發(fā)生肺等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)主要有腫瘤主要為膨脹性生長，腫瘤組織排列成實(shí)性片塊狀，缺乏腺管樣結(jié)構(gòu)，間質(zhì)成分較少，癌巢中部常見無細(xì)胞纖維區(qū)帶，癌腫周邊常見大量淋巴細(xì)胞浸潤，可見成片的地圖樣壞死，腫瘤細(xì)胞多形性、異型性明顯，呈合胞體樣，核濃染、核仁明顯［7］。

細(xì)胞凋亡指生物體內(nèi)的細(xì)胞在某一發(fā)育階段由基因調(diào)控的、自主的、有序的死亡過程［8］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡抑制與細(xì)胞增殖增強(qiáng)都是腫瘤發(fā)生的生物學(xué)基礎(chǔ)。其中，細(xì)胞調(diào)亡主要有兩條通路，即Fas/TNFR1介導(dǎo)的死亡受體通路及線粒體依賴通路。Apaf-1是一個(gè)具有多功能結(jié)構(gòu)域的蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量量為130 kD，是線粒體依賴途徑的關(guān)鍵蛋白酶之一，由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，其氨基末端有一個(gè)半胱氨酸蛋白酶募集域(CARD)，CED24同源域內(nèi)包含一個(gè)保守的P環(huán)，羧基末端則由12個(gè)WD240重復(fù)片段組成。Caspase家族是一種半胱氨酸蛋白酶家族，共分為三類，即凋亡啟動(dòng)因子、凋亡執(zhí)行因子及炎癥介導(dǎo)因子。凋亡啟動(dòng)因子位于級(jí)聯(lián)反應(yīng)的上游，包括 Caspase-8、Caspase-9等，細(xì)胞中的Caspase均以無活性的酶原形式(Pro-Caspase)存在，當(dāng)受到凋亡信號(hào)刺激后，通過對(duì)天冬氨酸殘基位點(diǎn)的蛋白水解而激活。當(dāng)細(xì)胞的凋亡刺激啟動(dòng)凋亡程序后，細(xì)胞色素C便從線粒體上特定的通道進(jìn)入胞液，在dATP的作用下，Apaf-1發(fā)生構(gòu)象改變而活化，活化的Apaf-1借助N端的CARD結(jié)構(gòu)域與Pro-Caspase-9分子中的CARD結(jié)構(gòu)域寡聚化，形成凋亡小體，這促使 Pro-Caspase-9自身活化，活化的Caspase-9激活下游的一系列Caspase成員，切割特定的凋亡底物，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［8～11］。董明明等［12］研究Apaf-1在肝細(xì)胞癌中表達(dá)率較癌旁正常組織明顯降低，婁毅等［13］檢測(cè)Apaf-1在胃癌中表達(dá)率較正常胃組織降低，潘科等［14］在胃癌中檢測(cè)Caspase-9表達(dá)較正常胃組織降低，王敏等［15］研究顯示，Caspase-9在胃癌中的表達(dá)率較癌旁正常組織明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些研究結(jié)果均與本研究結(jié)論一致。

本研究顯示，A組Apaf-1、Caspase-9均低于其余兩組，且Apaf-1表達(dá)與BLBC腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)，Caspase-9表達(dá)與BLBC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)，Apaf-1與Caspase-9陽性表達(dá)呈正相關(guān)，提示Apaf-1和Caspase-9與BLBC的發(fā)生、發(fā)展可能相關(guān)。

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