持續(xù)低溫灌注轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(AirdriveTM)影響犬腎保存的實(shí)驗(yàn)研究

朱緒輝 薛文瑞 張 強(qiáng) 王 偉 張際青 張小東 胡小鵬

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院泌尿外科，首都醫(yī)科大學(xué)泌尿外科研究所，北京100020)

器官保存的最主要目的是使移植器官在延長(zhǎng)的缺血時(shí)間的情況下具有良好的生存力和質(zhì)量。大多數(shù)移植器官采用靜止的冷藏保存，而隨著心臟死亡捐獻(xiàn)的器官和邊緣性器官應(yīng)用的增加，機(jī)器灌注的保存方法也引起了臨床醫(yī)生的關(guān)注。目前認(rèn)為，心臟死亡后捐獻(xiàn)的器官以及擴(kuò)大標(biāo)準(zhǔn)的捐獻(xiàn)器官對(duì)缺血損傷更敏感而機(jī)器灌注可能使之更加受益［1-2］。本研究采用荷蘭INDES公司生產(chǎn)的AirdriveTM持續(xù)機(jī)器灌注儀，探討其對(duì)犬腎低溫缺血損傷的保護(hù)作用?，F(xiàn)報(bào)告如下:

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康草犬1只，由首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):27801，犬齡3歲，體質(zhì)量13 kg，雄性。術(shù)前24 h禁食，自由飲水。

1.2 器材和藥品

AirdriveTM持續(xù)機(jī)器灌注儀由荷蘭INDES公司提供。灌注液使用UW液。

1.3 手術(shù)方法和供腎保存方法

經(jīng)草犬小腿前靜脈建立靜脈通路，靜脈誘導(dǎo)麻醉后，氣管插管吸入全身麻醉。建立中心靜脈輸液通路。取腹部正中切口，逐層切開，采用腹主動(dòng)脈插管原位灌注法，灌注液溫度維持在0～4℃，灌注壓9.8 kPa。待灌至腎臟呈均勻灰白色后切取雙側(cè)腎臟。將獲取的2只腎臟分別用普通低溫保存和持續(xù)機(jī)器灌注低溫保存。普通低溫保存的腎臟浸泡在冰水混合的HCA器官保存液中，并置于4℃的低溫房間內(nèi)存放。持續(xù)機(jī)器灌注保存的腎臟則置于AirdriveTM持續(xù)機(jī)器灌注儀中，該儀器置于室溫下存放。

1.4 觀察項(xiàng)目

1.4.1 組織病理學(xué)檢查

2組腎臟均于保存0、12、24以及48 h后取檢，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別取不同部位的組織6塊，分成不同的2組進(jìn)行配對(duì)比較，即普通低溫保存組和持續(xù)機(jī)器灌注組，部分腎組織用10%甲醛固定，梯度乙醇脫水，修剪后石蠟包埋切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，采用光學(xué)顯微鏡觀察其病理學(xué)改變。

1.4.2 電鏡檢查

觀察腎組織在不同保存方法的情況下，保存不同時(shí)間后(0、12、24、48 h)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別取不同部位的組織6塊，分成不同的兩組進(jìn)行配對(duì)比較，即普通低溫保存組和持續(xù)機(jī)器灌注組)。將標(biāo)本切成70～80 nm大小，按常規(guī)方法制成電鏡觀察標(biāo)本，用日立H-7000透射電鏡觀察。

1.4.3 腎皮質(zhì)線粒體活性測(cè)定

在不同時(shí)間段取腎臟皮質(zhì)標(biāo)本，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0、12、24、48 h)分別取不同部位的組織6塊，分成不同的2組進(jìn)行配對(duì)比較，即普通低溫保存組和持續(xù)機(jī)器灌注組)，稱質(zhì)量，制備勻漿。差速離心法分離線粒體，制成線粒體懸液，雙縮脲法測(cè)定其蛋白質(zhì)量濃度。Clark氧電極法測(cè)定線粒體活性。反應(yīng)室加線粒體懸液后，依次加入呼吸鏈反應(yīng)底物0.5 mol/L、琥珀酸20 μL及50 mmol/L二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)10 μL，分別出現(xiàn)Ⅱ態(tài)及Ⅲ態(tài)呼吸，待 ADP完全磷酸化后，出現(xiàn)Ⅳ態(tài)呼吸，連續(xù)描記四態(tài)呼吸曲線。根據(jù)反應(yīng)室體積和氧飽和度計(jì)算記錄紙每小格代表的氧含量 ，Ⅲ態(tài)或Ⅳ態(tài)耗氧速率(R3或R4)=每小格氧含量×Ⅲ態(tài)或Ⅳ態(tài)每分鐘耗氧格數(shù)(nmol/min)。計(jì)算線粒體呼吸控制率(respiratory control ratio，RCR=R3/R4)和磷氧比 (phosphorus oxygen ratio，P/O=ADP量/Ⅲ態(tài)耗氧量 )。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，同一時(shí)間點(diǎn)2組間差異用配對(duì)t檢驗(yàn)方法分析比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組保存不同時(shí)間供腎腎組織病理學(xué)改變

0～24 h腎組織的結(jié)構(gòu)基本相似。但48 h后，普通低溫保存的腎臟出現(xiàn)較明顯的改變，其中腎小管上皮細(xì)胞的改變比腎小球更為明顯。

實(shí)驗(yàn)前，腎小球未見顯著變化，腎小管上皮部分空泡變性，部分上皮刷狀緣脫落，細(xì)胞扁平，間質(zhì)未見顯著改變。

對(duì)照組48 h，腎小球毛細(xì)血管輪廓模糊，小管上皮廣泛的中、重度變性，可見數(shù)個(gè)小灶狀小管壞死。

實(shí)驗(yàn)組48 h，腎組織結(jié)構(gòu)改變輕微，可見輪廓清晰的腎小球、腎小管，除少量腎曲管輕度濁腫外，大部 分腎曲管結(jié)構(gòu)正常，詳見圖1。

圖1 腎組織切片HE染色Fig.1 HE staining of histologic sections(200×)

2.2 電鏡檢查結(jié)果

0～24 h腎組織電鏡圖像基本一致。但48 h后，普通低溫保存的腎臟出現(xiàn)較明顯的形態(tài)學(xué)改變，腎小管及腎小球的基膜厚度不均一。細(xì)胞內(nèi)褶明顯減少且紊亂。腎小管個(gè)別上皮細(xì)胞核出現(xiàn)核固縮，核緣呈鋸齒狀。線粒體基質(zhì)的電子密度明顯減低，嵴數(shù)量減少且排列紊亂，尤以近曲小管上皮更為顯著。上皮細(xì)胞的改變比腎小球更為明顯。

對(duì)照組48 h，核嚴(yán)重變形、核質(zhì)固縮，核膜不規(guī)整，線粒體顯著腫脹，嵴斷裂、溶解明顯，微絨毛分布散亂，大片脫落。

實(shí)驗(yàn)組48 h，核形大致正常，核質(zhì)分布均勻，線粒體輕微腫脹，但嵴排列尚良好，個(gè)別嵴膜間隙略增寬。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)亦有輕度腫脹。近曲小管上皮細(xì)胞微絨毛水腫、增粗，個(gè)別脫落。毛細(xì)血管內(nèi)皮與濾過(guò)膜內(nèi)皮細(xì)胞輕微水腫，結(jié)構(gòu)尚清，詳見圖2。

2.3 線粒體活性改變

隨著低溫保存時(shí)間延長(zhǎng)，持續(xù)機(jī)器灌注組和普通低溫保存組腎皮質(zhì)線粒體功能均明顯降低。保存12～48 h，普通低溫保存組Ⅲ態(tài)呼吸呼吸耗氧速率下降明顯且顯著低于持續(xù)機(jī)器灌注組(P＜0.05)。48 h普通低溫保存組較持續(xù)機(jī)器灌注組Ⅳ態(tài)呼吸耗氧顯著增加(P＜0.05)，余時(shí)間點(diǎn)2組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖3);48 h持續(xù)機(jī)器灌注組較普通低溫保存組皮質(zhì)RCR、P/O顯著增高，余時(shí)間點(diǎn)2組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。

3 討論

器官保存是器官移植學(xué)的三大技術(shù)支柱之一。理想的保存方法能為離體器官提供適宜的微環(huán)境，最大限度地延長(zhǎng)器官保存時(shí)間，一直是器官移植領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)［3］。迄今為止，大多數(shù)移植中心仍舊優(yōu)先采用靜止的冷藏保存方法。冷藏保存的原理是應(yīng)用低體溫來(lái)降低代謝，通過(guò)沖洗器官的血液代之以保存液［4］。機(jī)器灌注在冷藏保存常規(guī)應(yīng)用之前就已經(jīng)得到了發(fā)展。機(jī)器灌注的原則是應(yīng)用可控的連續(xù)性或者脈沖式的保存液循環(huán)來(lái)消除毒性代謝產(chǎn)物，提供營(yíng)養(yǎng)和氧分。理論上講，機(jī)器灌注能夠保護(hù)，至少是部分保護(hù)器官不受缺血再灌注損傷，因此可以改善移植器官的質(zhì)量［5］。機(jī)器灌注的原理是模擬器官在體內(nèi)的環(huán)境，使通過(guò)器官的流體不中斷，進(jìn)而來(lái)保護(hù)器官。其機(jī)制目前仍舊不十分清楚。低體溫機(jī)器灌注能夠降低基礎(chǔ)代謝，因此減少氧和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的消耗。灌注液的循環(huán)是通過(guò)管道器械裝置來(lái)達(dá)到連續(xù)性或者脈沖式的循環(huán)流動(dòng)。機(jī)器灌注至少在理論上能夠提供連續(xù)性的營(yíng)養(yǎng)和氧分，并且使得毒性代謝產(chǎn)物和自由基能夠被清除掉。機(jī)器灌注還能夠通過(guò)應(yīng)用實(shí)時(shí)的藥物和基因治療來(lái)改善器官的質(zhì)量［6］。此外，機(jī)器灌注還能夠減少血管痙攣并且提供流體和阻力等參數(shù)來(lái)評(píng)估器官的性能，這對(duì)生理?xiàng)l件下脈管的功能保護(hù)是非常重要的［7］。

圖2 電子顯微鏡圖像Fig.2 Electron microscope images(1 000 ×)

圖3 腎皮質(zhì)線粒體呼吸Ⅲ、Ⅳ態(tài)耗氧速率改變Fig.3 Changes in oxygen consumption rates of state Ⅲ and Ⅳ respirations in renal cortex mitochondria

圖4 腎皮質(zhì)線粒體功能變化Fig.4 Changes in mitochondrial function of renal cortex

研究［8］表明，在低溫保存中加強(qiáng)對(duì)線粒體功能的保護(hù)，能明顯減輕低溫缺血/再灌注損傷，提高器官保存效果。而線粒體通透性轉(zhuǎn)變(mitochondrial permeability transition，MPT)是低溫保存期間和再灌注后細(xì)胞凋亡和壞死信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵事件。因此本實(shí)驗(yàn)把低溫保存期間線粒體形態(tài)功能改變作為反映保存效果的重要指標(biāo)。線粒體Ⅲ態(tài)呼吸反映ADP對(duì)呼吸鏈活性的控制，Ⅳ態(tài)呼吸反映無(wú)ADP存在的情況下呼吸鏈耗氧速率，RCR反映線粒體結(jié)構(gòu)完整性及整體功能，P/O則反映其氧化釋放能量轉(zhuǎn)化為ATP的效率。上述指標(biāo)常用于器官低溫保存中監(jiān)測(cè)細(xì)胞損傷［9-10］。隨低溫缺血損傷加重，普通低溫保存組皮質(zhì)線粒體Ⅲ態(tài)呼吸耗氧速率下降，導(dǎo)致RCR、P/O明顯低于持續(xù)機(jī)器灌注組。這說(shuō)明持續(xù)機(jī)器灌注對(duì)線粒體低溫缺血損傷的保護(hù)作用比普通低溫保存強(qiáng)。2組多個(gè)時(shí)間點(diǎn)Ⅳ態(tài)呼吸耗氧增加可能與呼吸鏈解偶聯(lián)后，線粒體為維持自身膜電位病理性耗氧增加有關(guān)。研究［11］發(fā)現(xiàn)，脈沖式灌注與血流依賴的脈管內(nèi)皮基因的表達(dá)相關(guān)。在這些基因中KLF2(Kruppellike factor 2)可能通過(guò)抑制前炎性反應(yīng)、減少固有免疫系統(tǒng)的活化而在保護(hù)內(nèi)皮方面發(fā)揮重要的作用［12］。盡管如此，目前機(jī)器灌注的機(jī)制仍舊不十分明了。

總之，隨著使用邊緣器官的增多，持續(xù)機(jī)器灌注的應(yīng)用必將得到進(jìn)一步的推廣和廣泛應(yīng)用。而對(duì)于機(jī)器灌注保存，隨著其機(jī)制的不斷被發(fā)現(xiàn)，必將會(huì)更好的達(dá)到保護(hù)供體器官的目的。

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