向日葵葉中綠原酸微波輔助提取及抗氧化性研究

鐘姣姣，李萬林，劉軍海

（陜西理工學院化學與環(huán)境科學學院，陜西漢中723001）

向日葵是菊科屬植物，又名葵花、向陽花等[1]。它喜陽，耐旱。 其葉子形狀為心狀卵形或卵圓形。向日葵葉可分為子葉和真葉，其中真葉在莖下部1～3 節(jié)，常為對生，以上則為互生[2]。 向日葵葉子中含有新綠原酸、異綠原酸、綠原酸等化學成分，在中草藥中具有重要的藥用價值，對金黃色葡萄球菌有抑菌作用，也可作為抗瘧藥，同時還是治療高血壓、頭痛、頭暈、胃脘脹滿、腹痛等癥狀的有效原料。

綠原酸又名咖啡鞣酸，化學名為3-O-咖啡?？崴?，分子式為C16H18O9，分子量為345.30。研究表明，綠原酸藥理活性很強，具有利膽、抗菌、降壓、增加白血球、興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抗腫瘤、降脂、清除自由基等多種藥理作用，對消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)疾病均有顯著療效[3]。 它在醫(yī)藥、食品、化妝品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域有廣泛的應用。目前綠原酸的提取方法已有水提法、醇提法等，但對混合溶劑提取方法的研究還較少。 采用微波輔助提取法，操作簡單，可縮短生產(chǎn)周期，利用微波具有穿透能力強、選擇性高、加熱效率高等特點[4-5]，可使向日葵葉細胞內(nèi)的有效成分快速溶出。 本實驗可為建立一種有效提取向日葵葉中綠原酸的方法及抗氧化性的研究，并為向日葵葉總綠原酸的提取提供理論和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

向日葵葉：采摘于漢中市鎮(zhèn)巴縣某山區(qū)，需洗凈、55 ℃烘干、粉碎。

綠原酸標準品：西安小草植物科技有限公司；乙醇、丙酮、PBS 緩沖液（pH ＝7.4）、硫酸亞鐵、鄰二氮菲、Vc（抗壞血酸）、過氧化氫等，均為市售分析純。

1.2 儀器

Cary-50 紫外分光光度計 （美國瓦里安公司）； DGG-9140B 型電熱恒溫鼓風干燥箱 （上海森信公司）；FW-177 型中草藥粉碎機 （天津市泰斯特公司）；GR-200 型電子天平 （日本AND 公司）；HH-2 型電熱恒溫水浴鍋 （北京科偉興漢有限公司）；YC7134 油泵（溫嶺市速力電機廠）。

1.3 實驗步驟

1.3.1 綠原酸標準對照品最大吸收波長及標準曲線制作

1.3.1.1 綠原酸標準品的最大吸收波長

準確稱取綠原酸標準品1 mg，用無水乙醇定容至50 mL 容量瓶中。 以無水乙醇作參比液，在250 ～500 nm 范圍內(nèi)掃描，測定吸光度，篩選最大波長。以綠原酸吸收波長為橫坐標，以不同波長下的吸光度為縱坐標，制作綠原酸標準品的吸收波長光譜（圖1）。 由圖1 可知，綠原酸在329.9 nm處有最大吸收峰。 因此，應該選用329.9 nm 為綠原酸的最大吸收波長。

圖1 綠原酸標準品的吸收波長光譜

1.3.1.2 綠原酸標準曲線的繪制方法[6]

準確稱取經(jīng)55 ℃干燥至恒重的綠原酸標準品1 mg，置于50 mL 的容量瓶中，加適量的無水乙醇，使其充分溶解，再用無水乙醇定容至刻度線處，搖勻，即可得濃度為20 μg／mL 的綠原酸標準對照品。精確移取綠原酸標準品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 mL 分別置于10 mL的容量瓶中，分別用乙醇定容至刻度線處，搖勻，以無水乙醇為參比液，按分光光度法，在最大吸收波長329.9 nm 處測定其吸光度。

1.3.1.3 標準曲線的繪制

以吸光度A 為縱坐標，以綠原酸濃度C 為橫坐標繪制綠原酸標準曲線，得到吸光度A 與綠原酸 濃 度C 之 間 滿 足A ＝0.0394C+0.1125 （R2＝0.9995）的標準曲線（圖2）。

圖2 綠原酸標準曲線

1.3.2 向日葵葉中綠原酸的提取工藝流程

向日葵葉恒溫干燥→粉碎處理→過60 目篩→設(shè)定參數(shù)浸泡→微波輔助處理→過濾→抽濾→收集濾液。

1.3.3 綠原酸提取率的計算公式

取錐形瓶中濾液，將其稀釋后測量吸光度并帶入下式計算向日葵葉中綠原酸的提取率。

上式中：

W：向日葵葉中綠原酸提取率；

A：所測的吸光度；

N：綠原酸溶液稀釋倍數(shù)；

V：綠原酸濾液體積／mL；

M：向日葵葉粉末的質(zhì)量／g。

1.3.4 正交實驗設(shè)計

在單因素的試驗基礎(chǔ)上，以提取率為指標，選擇L16（45）設(shè)計表進行正交試驗。 正交試驗因素水平見表1。

表1 L16（45）正交試驗因素水平表

1.3.5 向日葵葉提取物抗氧化性的測定[7]

采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法，在10 mL 具塞試管中依次加入0.2 mL 濃度為7.5 mmol·L-1的鄰二氮菲溶液，2.0 mL pH ＝7.4 的PBS 緩沖液，0.2 mL 濃度為7.5 mmol·L-1的FeSO4和2 mL 綠原酸提取物不同濃度的樣品溶液，最后再加入1.0 mL 0.1%H2O2，每次加入試劑均需搖勻，使溶液充分混合，于40 ℃水浴中靜置反應60 min 后，在329.9 nm 處測定吸光度值。 根據(jù)測定的吸光度值按下式計算羥自由基的清除率：

式中：

A0：不含樣品，只含H2O2時的吸光度值；

A1：不含樣品，只含蒸餾水代替H2O2時的吸光度值；

A2：含樣品的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的比較

選取水、乙醇、丙酮、乙醇-丙酮四種溶劑作為提取劑，濃度都為99%，配制乙醇：丙酮體積比為1∶1，在料液比1∶15（向日葵粉末與體積分數(shù)為65%的乙醇配比）、 微波功率300 W、 微波溫度60 ℃、 浸泡時間120 s 的微波處理條件下分別進行實驗。按照1.3.3 測其吸光度，并計算提取率。研究了提取溶劑對向日葵葉中綠原酸提取率的影響，如圖3。

圖3 不同溶劑提取向日葵葉中綠原酸的比較

如圖3 可知，水提法提取向日葵葉中綠原酸提取率最低，乙醇提取法提取率次之，丙酮、乙醇-丙酮混合溶劑提取法提取率相近，都相對較高。水提法提取率低，可能是由于水的溫度較高使其他物質(zhì)溶出較多，且給分離帶來了困難；醇提法提取率相對高，可能是由于在醇溶液中，酶催化分解綠原酸作用受到抑制，使向日葵葉中綠原酸提取率降低。綠原酸更易溶于丙酮，考慮到試劑的價格較高，故采用乙醇溶劑為宜。

2.2 單因素結(jié)果與分析

2.2.1 乙醇體積分數(shù)對向日葵葉中綠原酸提取率的影響

準確稱取3 g 向日葵葉粉末，在微波處理時間為5 min、pH 值為7 的恒定條件下，控制微波功率為300 W、微波溫度為60 ℃、料液比為1∶15、浸泡時間為120 s，分別研究在乙醇體積分數(shù)為55%、60% 、65%、70%、75%時對向日葵葉中綠原酸提取率的影響。

表2 不同乙醇體積分數(shù)對向日葵葉中綠原酸提取率的影響

由表2 可知，乙醇體積分數(shù)小于65%時，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，向日葵葉的綠原酸提取率有顯著的提高，因為向日葵葉中綠原酸的極性更接近體積比為65%乙醇溶劑的極性； 超過乙醇體積分數(shù)65%時，提取率反而降低，可能是由于此時的乙醇中溶解了其他的物質(zhì)導致綠原酸提取率下降，故選擇乙醇體積分數(shù)65%為宜。

2.2.2 微波功率對向日葵葉中綠原酸提取率的影響

準確稱取3 g 向日葵葉粉末，在微波處理時間為5 min、pH 值為7 的恒定條件下，控制乙醇體積分數(shù)為65% 、微波溫度為60 ℃、料液比為1∶15 g／mL、浸泡時間為120 s，分別研究在微波功率為100 W、200 W、300 W、400 W、500 W 時對向日葵葉中綠原酸提取率的影響。

表3 不同微波功率對向日葵葉中綠原酸提取率的影響

由表3 可知，微波功率小于300 W 時，向日葵葉中綠原酸的提取率隨微波功率的升高而增加，這可能是由于強大的內(nèi)壓及分子間的摩擦力使向日葵葉細胞膜破裂綠原酸溶解速度加快，提取率增大；當微波功率超過300 W 時，提取率隨功率的升高反而下降，這可能是由于微波功率過大產(chǎn)生的局部過熱現(xiàn)象使綠原酸變性，從而使提取率下降。 故選擇微波功率300 W 為最佳。

2.2.3 微波溫度對向日葵葉中綠原酸提取率的影響

準確稱取3 g 向日葵葉粉末，在微波時間為5 min、pH 值為7 的恒定條件下，控制乙醇體積分數(shù)為65% 、微波功率為300 W、料液比為1∶15 g／mL、浸泡時間為120 s，分別研究在微波溫度為50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃時對向日葵葉中綠原酸提取率的影響。

表4 不同微波溫度對向日葵葉中綠原酸提取率的影響

由表4 可知，微波溫度小于60 ℃時，向日葵葉中綠原酸的提取率隨微波溫度的升高而加速上升，因為溫度升高，分子運動加快，使得細胞破裂，進一步導致向日葵葉中綠原酸的溶解及擴散速度加快，提取率顯著提高。微波溫度繼續(xù)增加時提取率反而下降，可能是因為向日葵葉中綠原酸隨著溫度的升高一部分有效成分被分解。 故選擇微波溫度60 ℃為宜。

2.2.4 料液比對向日葵葉中綠原酸提取率的影響

準確稱取3 g 向日葵葉粉末，在微波處理時間為5 min、pH 值為7 的恒定條件下，控制乙醇體積分數(shù)為65%、 微波功率為300 W、 微波溫度為60 ℃、浸泡時間為120 s，分別研究在料液比為1∶5 g／mL、1∶10 g／mL、1∶15 g／mL、1∶20 g／mL、1∶25 g／mL 時對向日葵葉中綠原酸提取率的影響。

表5 不同料液比對向日葵葉中綠原酸提取率的影響

由表5 可知，隨著料液比的增加，向日葵葉中綠原酸提取率不斷增加，當溶劑用量達到1∶20 g／mL 時，向日葵葉中綠原酸已基本溶出，再增加溶劑用量，提取率的增加幅度不大，考慮到成本問題，選擇料液比1∶20 g／mL 為宜。

2.2.5 浸泡時間對向日葵葉中綠原酸提取率的影響

準確稱取3 g 向日葵葉粉末，在微波處理時間為5 min、pH 值為7 的恒定條件下，控制乙醇體積分數(shù)為65%、微波功率為300 W、微波溫度為60℃、料液比為1∶20 g／mL，分別研究在浸泡時間為60 s、90 s、120 s、150 s、180 s 的條件下對向日葵葉中綠原酸提取率的影響。

表6 不同浸泡時間對向日葵葉中綠原酸提取率的影響

由表6 可知，浸泡時間對向日葵葉中綠原酸提取率有一定的影響，浸泡時間過短時，則綠原酸還未完全溶解，提取率低；浸泡時間過長，提取溶劑揮發(fā)，使提取率變低；當浸泡時間為150 s 時，綠原酸的溶解基本達到平衡，提取率最高。故選擇浸泡時間以150 s 為宜。

2.3 正交試驗對向日葵葉中綠原酸提取工藝的優(yōu)化

在單因素的基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分數(shù)（A）、微波功率（B）、微波溫度（C）、料液比（D）、浸泡時間（E）為影響因素，以提取率為指標，選擇L16（45）進行正交試驗，正交結(jié)果見表7。

表7 正交試驗結(jié)果

由直觀分析圖可知，各因素對向日葵葉中綠原酸微波提取工藝的影響順序為浸泡時間＞乙醇體積分數(shù)＞微波溫度＞微波功率＞料液比，最佳提取工藝條件為A3B3C3D2E3，即浸泡時間為150s，微波溫度為60 ℃，微波功率為300 W，乙醇體積分數(shù)為65%，料液比為1∶15 g／mL 時，在最佳因素組合的條件下進行三次平行實驗，提取率分別為3.802%、3.801%、3.804%，取其平均值，得最優(yōu)組合的提取率為3.802%。

2.4 向日葵葉提取物抗氧化性測定

稱取向日葵葉粉末5 g 置于圓底燒瓶中，配制乙醇體積分數(shù)為65%，在料液比為1∶15 g／mL 時，浸泡150 s，設(shè)溫度60 ℃條件下微波處理5 min（最佳工藝條件），趁熱過濾，抽濾得綠原酸提取液，配制成不同濃度的樣品溶液，以相同濃度的Vc 作陽性對照品。 用鄰二氮菲-Fe2+氧化法測定向日葵葉提取液清除·OH 的能力。 重復上述步驟，結(jié)果如圖4。

圖4 Vc、向日葵葉中綠原酸提取液對·OH 的清除率

測定得向日葵中綠原酸提取液和Vc 對·OH的最大清除率分別為74.30%、 80.49%，且隨著濃度的增加，清除率也不斷增加。 結(jié)果表明，綠原酸提取液對向日葵葉有較強的抗氧化性，且比Vc的抗氧化能力強。

3 結(jié)語

（1）向日葵葉中富含綠原酸，是一種可利用的綠原酸資源。通過單因素實驗、正交實驗及響應面優(yōu)化提取工藝得出最優(yōu)組合為浸泡時間150 s，微波溫度60 ℃，微波功率300 W，乙醇體積分數(shù)65%，料液比1∶15 g／mL 時，可達到最佳提取效果。在此最佳工藝組合下，向日葵葉中綠原酸的提取率可達3.802%。

（2）用鄰二氮菲-Fe2+氧化法測定了最佳工藝條件下向日葵葉中綠原酸提取液對·OH 的清除率為80.49%，結(jié)果表明，向日葵葉中綠原酸提取液具有較好的抗氧化性，為綠原酸及其功能性成分的進一步開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

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