紫草多糖的提取、純化及藥理作用研究進(jìn)展

朱沛沛，李濤濤，趙偉龍，袁磊，線夢瑤

（陜西理工學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西 漢中723001）

紫草（Lithospermumerythrorhizon），又名茈草，紫丹，地血，紅石根，是紫草科草本植物紫草的根，國內(nèi)分布廣泛，以新疆所產(chǎn)紫草品質(zhì)最佳。紫草味甘、性寒、歸心包絡(luò)，有涼血、活血、清熱解毒等功效[1]，作為中草藥在我國已經(jīng)有幾千年的應(yīng)用歷史，其根藥用，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。 紫草中含有萘醌類、單萜苯醌、苯酚類、酚酸類以及多糖類等多種具有生物活性的物質(zhì)[2]。

多糖是一類非特異性免疫增強(qiáng)化合物，能提高機(jī)體的免疫功能，具有抗衰老、抗癌、抗病毒等作用，受到人們的普遍重視，進(jìn)行了相關(guān)的研究和開發(fā)。我國十分重視糖類藥物的開發(fā)，國家科技部已經(jīng)把“糖生物學(xué)與重大疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究” 列入了未來十年對生物經(jīng)濟(jì)起引領(lǐng)作用的重大生命科學(xué)的應(yīng)用基礎(chǔ)研究課題。 近年來的研究成果表明，紫草多糖具有抗病毒、調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤、抗輻射及降血糖降血脂等功能[3]，已經(jīng)逐步應(yīng)用到日化、醫(yī)藥及保健食品等領(lǐng)域。本文系統(tǒng)介紹紫草多糖的研究進(jìn)展，旨在為紫草多糖的研究及應(yīng)用提供有益的參考。

1 紫草多糖含量的測定

目前紫草多糖含量的測定方法包括高效液相色譜法（HPLC）、紫外分光光度法及薄層掃描法。在測定紫草多糖含量之前，要進(jìn)行顯色反應(yīng)，顯色方法包括苯酚-硫酸法、 蒽酮-硫酸法、3，5-二硝基水楊酸法、斐林法，其中苯酚-硫酸法重現(xiàn)性好，精確度高，受實(shí)驗(yàn)溫度及時(shí)間的影響最小，是紫草多糖含量測定最常用的顯色方法。 其原理是利用多糖或寡糖被濃硫酸在適當(dāng)高溫下水解，產(chǎn)生單糖，并迅速脫水成糠醛或其衍生物，然后再與α-萘酚、間苯二酚或苔黑酚（orici-nol，即5-甲基-1，3-間苯二酚）等酚類縮合或胺類化合物縮合。其中苯酚-硫酸法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的測定，依據(jù)糖經(jīng)濃硫酸處理后脫水產(chǎn)生糠醛或糠醛衍生物，再與苯酚縮合生成橙黃色物質(zhì)，于490.00 nm 處比色。 其化學(xué)反應(yīng)過程如圖1 所示。

第一步：糖類遇濃硫酸脫水：

第二步：糠醛與苯酚縮合顯色：

圖1 苯酚-硫酸法測定還原性糖原理

紫外分光光度法由于其方便快捷在紫草多糖的定量分析測定中應(yīng)用較廣泛，但其測定的多糖純度低，易受外界實(shí)驗(yàn)條件的影響，準(zhǔn)確性難以保障。 高效液相色譜法選擇性高并且可以排除多糖中與蒽酮-硫酸反應(yīng)時(shí)反應(yīng)的雜質(zhì)，得到紫草樣品多糖的絕對含量。 薄層掃描法（TLCS）系指用一定波長的光照射在薄層板上對薄層色譜中有紫外或可見光吸收的斑點(diǎn)或經(jīng)照射能激發(fā)產(chǎn)生熒光的斑點(diǎn)進(jìn)行掃描，將掃描得到的圖譜及積分值用于藥品質(zhì)量檢查的方法。 該方法所需溶劑較少，樣品分離效果較好。 在實(shí)際應(yīng)用中可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求、合理性及準(zhǔn)確性選擇合適的方法測定紫草多糖含量。

2 紫草多糖的提取及純化

2.1 紫草多糖的提取

有關(guān)紫草多糖的研究報(bào)導(dǎo)不多，主要集中在紫草多糖的提取方面。 目前使用的提取方法主要包括超聲波提取、溶劑提取、酶提取、微波提取及各種提取方法聯(lián)用提取。 提取大多采用水作為提取劑，安全環(huán)保且提取經(jīng)濟(jì)價(jià)值高。其他提取方法的適用性及經(jīng)濟(jì)性還有待研究者探索。

2.1.1 超聲波提取法

超聲波提取法是應(yīng)用超聲波對媒質(zhì)產(chǎn)生的機(jī)械振動和空化作用進(jìn)行物理破碎，強(qiáng)化天然產(chǎn)物的提取的一種新興的生物提取技術(shù)。 超聲波振動產(chǎn)生并傳遞強(qiáng)大的能量，使媒質(zhì)的運(yùn)動加速繼而使結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，促使有效成分進(jìn)入溶劑中。同時(shí)超聲波還具有熱效應(yīng)、乳化、擴(kuò)散、擊碎、化學(xué)效應(yīng)、生物效應(yīng)、凝聚效應(yīng)等許多次級效應(yīng)，可加快提取物的溶解及擴(kuò)散速度。

李芳等[4]運(yùn)采用超聲技術(shù)輔助水提醇沉法從新疆紫草中提取多糖并用酚-硫酸比色法測定多糖含量，結(jié)果表明多糖含量達(dá)2.267%，RSD＝0.48%（n ＝6）。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超聲波提取技術(shù)反應(yīng)速度快，收率高。

超聲波提取技術(shù)因其操作簡便、時(shí)間短、產(chǎn)率高、 能耗低及產(chǎn)物易分離提純等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用，用于紫草多糖的提取優(yōu)勢明顯，是近年來紫草多糖提取領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，也是今后工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)展趨勢。此外，超聲波還具有一定的殺菌作用，同時(shí)其絮凝作用使得浸出液易澄清過濾，有利于后期產(chǎn)品的精制純化。 但其大功率的發(fā)生器產(chǎn)生的噪音對人體健康有一定的潛在危害，如需大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)還需進(jìn)一步改善。

2.1.2 溶劑提取法

溶劑提取法作為植物多糖常用的提取方法，首先要考慮選擇何種溶劑才能將目標(biāo)產(chǎn)物完全提取，選擇時(shí)一般都遵循相似相溶原則。多糖屬極性大分子化合物，水和醇等極性強(qiáng)的溶劑有利于其提取。水是典型的強(qiáng)極性溶劑，對植物組織的穿透力強(qiáng)，提取效率高，使用安全且提取成本低，是植物多糖提取的首選溶劑。

用水作溶劑提取植物多糖時(shí)，可采用熱水浸煮提取，也可以用冷水浸提。水提取的多糖多數(shù)是中性多糖。一般植物多糖提取多數(shù)采用熱水浸提法，該法所得多糖提取液可直接或離心除去不溶物，減少了純化工段的程序。 朱艷紅等[5]以水作為提取劑對紫草多糖進(jìn)行提取，并采用正交實(shí)驗(yàn)對工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳提取工藝：煎煮3 次，加水15 倍量，煎煮1 h，優(yōu)選得到的工藝經(jīng)濟(jì)、簡單、穩(wěn)定、可行。

溶劑提取是傳統(tǒng)的提取方法，具有操作簡單、不需特殊設(shè)備、成本低等優(yōu)點(diǎn)，是目前紫草多糖廣泛應(yīng)用的提取方法。 但此法提取率低、 費(fèi)時(shí)，而且提取物純度差，因此有逐漸被淘汰的趨勢。

2.1.3 酶提取法

酶技術(shù)能夠降低提取條件，在比較溫和的環(huán)境下分解植物組織，加速多糖的滲出，有助于提取，同時(shí)還能夠有效地保護(hù)提取成分，可用于紫草多糖的工業(yè)化生產(chǎn)。 常用的酶有蛋白酶、 纖維素酶、果膠酶等。

雖然酶法提取紫草多糖的應(yīng)用起步較晚，但高效的提取效果及低能耗等優(yōu)點(diǎn)使得其推廣較快，備受關(guān)注。同時(shí)酶法和其他提取方法聯(lián)用能夠更好地提高提取率。 李倩等[6]研究了超聲波復(fù)合酶法提取軟紫草多糖，采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到超聲波復(fù)合酶法提取軟紫草多糖的最佳工藝： 超聲處理時(shí)間40 min，料液比1∶12，功率160 W，酶解時(shí)間40 min，酶解溫度55 ℃，pH ＝5.5，纖維素、果膠酶、蛋白酶添加量均為2%，多糖的提取率達(dá)4.46%，表明超聲波復(fù)合酶法雙重處理可顯著提高軟紫草多糖的提取率。

酶解法提取工藝簡單、條件溫和、節(jié)能環(huán)保，符合21 世紀(jì)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的要求，還可以保護(hù)提取物有效組分，提高目標(biāo)產(chǎn)物的藥用價(jià)值，但單獨(dú)使用酶解法提取紫草多糖提取效果不理想，所以今后的研究應(yīng)主要集中在與多種高效的提取方法結(jié)合聯(lián)用的方向，結(jié)合各提取方法的優(yōu)點(diǎn)提高紫草多糖的提取率。

2.1.4 微波提取法

微波輻射過程產(chǎn)生的高頻電磁波能夠穿透萃取介質(zhì)，到達(dá)物質(zhì)的內(nèi)部，由于吸收微波能，細(xì)胞內(nèi)迅速升溫，細(xì)胞壁壓力增大膨脹破裂，細(xì)胞內(nèi)有效成分流出，溶解到提取劑中，通過進(jìn)一步過濾和分離，即得到萃取物質(zhì)。 此外，微波所產(chǎn)生的電磁場能加速被萃取成分向萃取劑界面的擴(kuò)散速率。該法提取時(shí)間短，提取率高，是強(qiáng)化固液提取過程頗具發(fā)展?jié)摿Φ囊豁?xiàng)新型輔助提取技術(shù)。

曲曉蘭等[7]研究了水提醇沉法提取紫草多糖的工藝條件，采用苯酚-硫酸比色法于490 nm 波長處測定其多糖含量。 結(jié)果測得紫草中多糖含量為2.93%，平均回收率為99.28%，RSD＝1.22（n＝5）。 楊秀芳[8]以水為介質(zhì)進(jìn)行了微波場協(xié)同提取紫草多糖的研究，得到了微波場協(xié)同提取紫草多糖的最佳工藝參數(shù)：水和紫草質(zhì)量比15∶1，時(shí)間8 min，微波功率320 W，提取2 次，合并濾液，濃縮，用無水乙醇沉淀，水洗濾餅干燥后即得粗產(chǎn)品，紫草多糖含量為6.46%。

微波輔助提取技術(shù)一般只需數(shù)分鐘就能達(dá)到其他提取技術(shù)的提取效果，具有萃取時(shí)間短、產(chǎn)率高、能耗低、溶劑用量少等優(yōu)點(diǎn)，使其在各個(gè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。但微波升溫迅速、較難控制且易破壞多糖分子結(jié)構(gòu)，造成一定程度的分解失活，影響提取物產(chǎn)品質(zhì)量，如何更好地調(diào)節(jié)時(shí)間及溫度的平衡顯得非常重要。

2.2 紫草多糖的純化

初步提取所得多糖雜質(zhì)含量較多，必須經(jīng)過進(jìn)一步的純化才能得到高純度多糖。 通過水提所獲得的紫草粗多糖常含有較多的蛋白質(zhì)和非糖成分。 純化是為了除去粗活性多糖中的雜質(zhì)而獲得單一活性多糖組分的過程。 純化的第一步就是將粗活性多糖中的非活性多糖組分除去，一般的程序是先除去蛋白后除去其它小分子雜質(zhì)，再進(jìn)行脫色去離子等步驟即得到純度較高的紫草多糖。

2.2.1 除蛋白

傳統(tǒng)的除蛋白方法有三氯乙酸法、 鞣酸法、Sevag e 法、Sevage 加蛋白酶、BECM 法等[9]。 酸沉淀法可以造成某些多糖的降解，使多糖得率受到影響；Sevage 法是用氯仿和正丁醇按5∶1 的比例混合后，加入粗多糖溶液中，在劇烈震動后，離心除去蛋白質(zhì)，但該法使用氯仿和正丁醇作為試劑毒性較大，容易造成多糖活性下降和溶劑殘留，而且效率也不高。 Sevage 加蛋白酶的方法是在Sevage 方法的基礎(chǔ)上，加入蛋白酶進(jìn)行分離的方法，該法雖然安全，但通常酶解不夠充分，細(xì)化程度低。郭代英[10]采用了傳統(tǒng)的Sevag e 法和3%三氯乙酸法除去無花果多糖提取物中蛋白類成分，結(jié)果顯示，Sevag e 法蛋白質(zhì)清除率稍低于3%三氯乙酸法，多糖損失率大于3%三氯乙酸法。 采用BECM 法除去蛋白，即將正丁醇、乙醇、氯仿、甲醇、NaCl 按一定比例混合制成一種特殊的試劑，然后加到多糖溶液中。 BECM 法[11]脫蛋白的結(jié)果表明，雜蛋白的去除率為99.98%，且工藝簡單，無需大的動力和設(shè)備，大大降低了運(yùn)轉(zhuǎn)成本。

2.2.2 脫色

植物多糖的提取物大多含有酚類化合物，在提取過程中容易氧化生成其他色素，這類色素大多呈負(fù)性離子，它的存在會影響多糖的色譜分析和性質(zhì)測定?；钚蕴课談┟撋珣?yīng)用于此類色素效果差，可用離子交換柱DEAE-纖維素、氧化劑（H2O2）、吸附劑（纖維素、硅藻土、活性炭等）或Duolite A-7 來吸附色素。樹脂也是一種吸附性質(zhì)的脫色劑，它的理化性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于酸、堿及有機(jī)溶劑，對有機(jī)物選擇性較好，不受無機(jī)鹽類及強(qiáng)離子低分子化合物存在的影響，可以通過物理吸附從水溶液中有選擇地吸附有機(jī)物質(zhì)。 若糖與色素是結(jié)合的，易被DEAE 纖維素吸附，不能被水洗脫，這類色素可進(jìn)行氧化脫色，一般以濃氨水或NaOH 液調(diào)至pH ＝8.0 左右，50℃以下滴加H2O2至淺黃色，保溫2 h。陳祥娜[11]采用活性炭、DEAE-纖維素和DEAE-纖維素+1 mol／L NaCl 進(jìn)行脫色實(shí)驗(yàn)比較。 從色澤變化來看，活性炭脫色效果最差，為棕黑色；DEAE-纖維素脫色效果最好，為棕黃色；DEAE-纖維素+1 mol／L NaCl 脫色效果次之，為深棕色。 由于DEAE-纖維素脫色后多糖的損失最大，DEAE-纖維素+1 mol／L NaCl 的脫色效果和DEAE-纖維素相差不大，綜合考慮，DEAE-纖維素是一個(gè)相對較好的脫色材料，與1mol／L 的NaCl 配合使用效果最佳。

2.2.3 去離子

去離子是為進(jìn)一步純化及色譜分析做準(zhǔn)備，也就是除去小分子雜質(zhì)，如無機(jī)鹽、脫蛋白殘留溶劑、低聚糖等。 常用的方法有透析法、柱離子交換法和纖維濾器透析法。 透析法是最傳統(tǒng)的去離子方法，它是利用一定孔目的膜，使無機(jī)鹽或小分子糖透過，而將大分子的多糖截留下來，從而達(dá)到純化多糖的目的。 在透析前要選擇一種規(guī)格適宜的透析膜，以免樣品損失。 纖維膜孔徑為2 ～3 nm，可使單糖分子通過，分離效果較好，透析時(shí)常需要多次換水，溶液的pH 值維持在6.0 ～6.5 范圍內(nèi)。該法操作簡單、技術(shù)成熟，但周期長，往往需要2 d ～3 d，常溫下操作有可能造成多糖的霉變，必要時(shí)需加入少量防腐劑或需在低溫條件下進(jìn)行。 提取液除去蛋白后，分別通過陰陽離子交換樹脂，也可以用G-25 以達(dá)到去離子作用，該法比較簡單，但是增大了溶液的體積，影響多糖的沉淀結(jié)果。 纖維濾器透析法根據(jù)膜分離技術(shù)利用不同孔徑的膜使大小不同的分子分級，以這種方式對大多數(shù)樣品進(jìn)行濃縮，速度很快，可縮短生產(chǎn)周期，而且條件溫和，是多糖脫除雜質(zhì)的一條新途徑。

3 紫草多糖的藥理作用

3.1 抗病毒作用

紫草在試管實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，對京科68-1 病毒有抑制作用。 紫草水煎劑能延緩和減輕單純皰疹病毒對乳兔腎細(xì)胞致病變作用的產(chǎn)生，紫草多糖在乳兔細(xì)胞上對單純皰疹病毒Ⅰ型（HSV21）有明顯的抑制作用，其抗病毒機(jī)制是在宿主細(xì)胞內(nèi)抑制HSV21 的復(fù)制，同時(shí)紫草多糖亦有抗皰疹病毒地方株的作用。應(yīng)靜芝[12]對1 例14 個(gè)月的皰疹性口炎患者應(yīng)用紫草等中藥，水煎服，連用5 劑，口內(nèi)皰疹痊愈。 皰疹性口炎是由單純皰疹病毒引起的感染性疾病，該例治療在銀翹散疏風(fēng)解表清熱的基礎(chǔ)上，重用紫草抗炎抗病毒，收效滿意，表明紫草多糖具有一定的抗病毒功效。

3.2 免疫調(diào)節(jié)作用

從紫草的根中分離得到的咖啡酸四聚體單鈉和單鉀鹽具有明顯的抗人類免疫缺陷病毒活性，表明紫草具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。 羅學(xué)婭等[13]發(fā)現(xiàn)從紫草根水煎劑中提取出的有效成分紫草多糖可促進(jìn)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能，增加脾臟中T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和T 淋巴細(xì)胞功能，促進(jìn)遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)，說明紫草多糖對機(jī)體具有增強(qiáng)特異性和非特異性免疫的作用。此外，紫草復(fù)方在一定劑量范圍內(nèi)，體內(nèi)體外試驗(yàn)中均能提高自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell ，NK 細(xì)胞）殺傷靶細(xì)胞的活性，提高機(jī)體免疫功能，發(fā)揮對淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)功能。張秀娟[14]研究了紫草多糖對S180 荷瘤小鼠紅細(xì)胞膜磷脂脂肪酸含量及脂肪酸組分的影響。 與陰性對照組比較，紫草粗多糖低、中、高給藥組小鼠紅細(xì)胞膜中，C16∶1、C18∶1、C18∶2、UFA／TFA 的比例有不同程度的升高，其中C18∶2、UFA／TFA 的中劑量組有顯著性差異（P ＜0.01）；而紫草粗多糖低、中劑量組C16∶0 與陰性對照組比較有所降低，其中中劑量組有顯著性差異（P ＜0. 01）；同時(shí)紫草粗多糖組C18∶0 的百分含量較陰性對照組稍有降低，但無差異。紫草多糖通過影響荷瘤動物紅細(xì)胞膜磷脂脂肪酸的含量與組分，增強(qiáng)了膜的流動性，從而調(diào)整紅細(xì)胞的免疫功能。

3.3 抗腫瘤活性

紫草多糖具有一定的腫瘤抑制活性，在體外對腫瘤細(xì)胞有直接的殺傷作用。 陳祥娜等[15]采用MTT 法檢測紫草多糖對淋巴細(xì)胞增殖及對HepG2、SPC-A-1 腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。通過比較紫草多糖對HepG2 和SPC-A-1 腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用顯示，紫草多糖對HepG2 和SPC-A-1 腫瘤細(xì)胞都有抑制作用，但相同濃度下對兩種腫瘤細(xì)胞的抑制效果不同，與對SPC-A-1 細(xì)胞的抑制作用相比，高劑量濃度對HepG2 細(xì)胞的抑制作用明顯強(qiáng)，顯示出更大的劑量依賴性。分析推測紫草多糖的腫瘤殺傷作用可能是由于改變了腫瘤細(xì)胞膜的生化特性，從而起到直接抑制腫瘤細(xì)胞生長的效果，同時(shí)還對腫瘤細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒作用。 張秀娟[16]觀察紫草多糖對S180 荷瘤小鼠瘤重、紅細(xì)胞膜流動性和帶3 蛋白含量的影響，采用熒光探針DPH 標(biāo)記法測定紅細(xì)胞膜的熒光偏振度P，計(jì)算微黏度與膜脂流動性；電泳法測定紅細(xì)胞膜帶3 蛋白含量。結(jié)果表明：紫草多糖中劑量組抑瘤率達(dá)43.05%； 且各劑量組對紅細(xì)胞膜膜脂流動性、 帶3 蛋白均有影響，以中劑量組效果最佳，與對照組相比P ＜0.01，P ＜0.05。 紫草多糖通過影響荷瘤小鼠紅細(xì)胞膜流動性和帶3 蛋白，恢復(fù)紅細(xì)胞的正常功能，發(fā)揮其抗腫瘤作用。

4 結(jié)語

我國紫草資源豐富，為紫草多糖的研究提供了保障。目前紫草多糖的提取工藝已經(jīng)趨向成熟，重點(diǎn)在于開發(fā)新型的提取技術(shù)和工藝的優(yōu)化。 紫草多糖的研究難點(diǎn)及熱點(diǎn)聚焦在藥理研究及生物活性上，多糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性賦予了其多樣的生物活性，同時(shí)也在一定程度上限制了糖類藥物的深入研究，因此多糖結(jié)構(gòu)與相應(yīng)的活性之間的關(guān)系即構(gòu)效關(guān)系的研究，對定向設(shè)計(jì)藥物結(jié)構(gòu)，研發(fā)新藥具有重要的指導(dǎo)意義。此外，還應(yīng)該加強(qiáng)紫草多糖的安全性能研究，以期早日在醫(yī)藥、日用化工及食品等領(lǐng)域發(fā)揮重大作用，全面提升紫草多糖的應(yīng)用價(jià)值。

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