哈爾濱師范大學(xué)樣地土壤微生物的分離及鑒定*

邢卉研，王繼華，魏京燾

(哈爾濱師范大學(xué))

0 引言

土壤微生物是衡量土壤生態(tài)環(huán)境的重要指標(biāo)之一，它們參與土壤中的許多生物化學(xué)反應(yīng)過程．自然界中凡是肉眼看不清楚或看不見的微小生物統(tǒng)稱土壤微生物，一般包括細(xì)菌、真菌、放線菌、古菌、原生動物、纖維藻類和病毒等［1］．微生物在土壤營養(yǎng)元素循環(huán)過程中起著十分關(guān)鍵的作用，細(xì)菌通過其自身的生理特性可引起土壤成分變化，調(diào)節(jié)土壤酸堿性等，為農(nóng)作物的生長提供營養(yǎng)［2］．

主要研究哈爾濱師范大學(xué)大豆樣地土壤微生物的種類和生理生化特性．認(rèn)識土壤微生物結(jié)構(gòu)，能夠更好地發(fā)揮土壤微生物的功能，為改良土壤，提高產(chǎn)量提供科學(xué)依據(jù)，為工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)服務(wù)［3］．因此研究土壤微生物結(jié)構(gòu)的變化及微生物與生態(tài)環(huán)境之間的關(guān)系具有重要的科研和實(shí)踐意義．

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

土壤樣品取自于哈爾濱師范大學(xué)大豆試驗(yàn)田，采集土壤樣品裝入無菌聚乙烯袋后密封，土壤帶回實(shí)驗(yàn)室立即進(jìn)行土壤微生物分離，剩余土樣放入4℃冰箱進(jìn)行保存．

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 微生物數(shù)量統(tǒng)計(jì)

土壤微生物(細(xì)菌、放線菌、真菌)的菌群數(shù)量單位為個/g干土，數(shù)量采用平板稀釋涂布方法測定．

細(xì)菌數(shù)量的測定采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，以平板表面涂抹法或平板傾注法，按公式1計(jì)算細(xì)菌數(shù)．放線菌數(shù)量測定采用改良的高氏Ⅰ號培養(yǎng)基．真菌采用鏈霉素-馬丁氏孟加拉紅培養(yǎng)基進(jìn)行涂布計(jì)數(shù)．將所得數(shù)據(jù)記錄結(jié)果．

公式1:菌數(shù)=菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)/干土%

1．2．2 微生物分離、純化及鑒定

采取傳統(tǒng)微生物分離方法，對土樣的微生物進(jìn)行分離、純化，進(jìn)行形態(tài)觀察并記錄．對純化的細(xì)菌菌株進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，包括接觸酶(過氧化氫)試驗(yàn)，尿素試驗(yàn)，苯丙氨酸脫氫酶試驗(yàn)，糖發(fā)酵(葡萄糖、蔗糖、淀粉)試驗(yàn)，甲基紅(M．R．)試驗(yàn)，乙酰甲基甲醇(V．P．)試驗(yàn)，淀粉水解試驗(yàn)，纖維素水解試驗(yàn)，吲哚試驗(yàn)，檸檬酸鹽試驗(yàn)和油脂水解試驗(yàn)．測試細(xì)菌的對生物大分子，含C或含N化合物的利用情況，并記錄結(jié)果．

用不同的生理生化指標(biāo)培養(yǎng)特征作為鑒定放線菌的依據(jù)．生理生化實(shí)驗(yàn)包括:吲哚實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)硫化氫實(shí)驗(yàn)、牛奶石蕊實(shí)驗(yàn)、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)(葡萄糖、乳糖、麥芽糖)．

對土壤真菌的鑒定主要依據(jù)真菌菌落特征、菌絲體特征以及孢子著生位置和形態(tài)特點(diǎn)．對真菌的菌落形態(tài)特征觀察并記錄．

依據(jù)經(jīng)典的微生物分類方法，對菌種的形態(tài)學(xué)特征及生理生化特征進(jìn)行測定，主要依據(jù)微生物的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和生態(tài)學(xué)特征進(jìn)行初步的分類，并參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》(第八版)［4］、《微生物分類學(xué)》［5］進(jìn)行鑒定．

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2．1 土壤中三大類微生物的數(shù)量

土壤微生物在土壤中的數(shù)量、分布與活動情況，反映了土壤肥力的高低，因此常用作評價土壤質(zhì)量，維持生產(chǎn)力、保護(hù)環(huán)境質(zhì)量以及維持系統(tǒng)健康的生物指標(biāo)．

實(shí)驗(yàn)對哈爾濱師范大學(xué)大豆耕地土壤微生物數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(見表1)．結(jié)果表明在土壤微生物三大類群微生物組成中，細(xì)菌數(shù)量占絕對優(yōu)勢，放線菌數(shù)量次之，真菌數(shù)量最少．

表1 三大類微生物在土壤中的數(shù)量組成

2．2 土壤微生物分類鑒定結(jié)果

2．2．1 細(xì)菌形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

研究細(xì)菌的生理生化反應(yīng)主要觀察細(xì)菌的代謝特征，對營養(yǎng)源的利用情況，生長發(fā)育條件，能否產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、產(chǎn)堿等．本次實(shí)驗(yàn)共分離獲得細(xì)菌25株，生理生化實(shí)驗(yàn)表明:土壤中大多數(shù)細(xì)菌不能水解油脂和明膠，多數(shù)菌種可以水解纖維素和淀粉，所得菌種均不產(chǎn)氨，多數(shù)能還原硝酸鹽，僅少數(shù)菌種能夠發(fā)酵葡萄糖、淀粉產(chǎn)酸，多數(shù)能發(fā)酵蔗糖產(chǎn)酸或既產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，接觸酶反應(yīng)、吲哚反應(yīng)大部分為陽性，石蕊牛奶實(shí)驗(yàn)多數(shù)產(chǎn)堿、胨化．

利用《微生物分類學(xué)》等，根據(jù)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)特征和生理生化特征，對分離菌株進(jìn)行初步的鑒定，鑒定結(jié)果(見表2)．土壤中25株細(xì)菌分別屬于12個不同菌屬:其中芽孢桿菌屬約占44%、固氮菌屬約占8%、微球菌屬及假單胞菌屬也占8%、芽孢八疊球菌屬約占4%、黃單胞菌屬占4%、鹽桿菌屬及動性球菌屬也占4%．

表2 細(xì)菌菌屬鑒定結(jié)果

2．2．2 放線菌形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

放線菌主要存在于土壤環(huán)境中，絕大多數(shù)能夠產(chǎn)生抗生素，是土壤微生物重要的成員．實(shí)驗(yàn)對土壤放線菌進(jìn)行培養(yǎng)、分離、純化得到優(yōu)勢菌種，共分離獲得放線菌10株．放線菌的生理生化實(shí)驗(yàn)主要包括:淀粉水解、接觸酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)(葡萄糖、蔗糖)．實(shí)驗(yàn)表明，大部分土壤放線菌能夠產(chǎn)生過氧化氫酶，但大部分土壤放線菌不能夠水解淀粉，硝酸鹽還原反應(yīng)大部分為陽性，多數(shù)放線菌能夠發(fā)酵糖類產(chǎn)酸．經(jīng)鑒定，分別屬于7個不同菌屬(見表3):鏈霉菌屬(Streptomyces)3株、羅氏菌屬(Rothia)、線桿菌屬(Bacterionema)2株、諾卡氏菌屬(Nocardia)、假諾卡氏菌屬(Pseuconocardia)、鏈孢囊菌屬(Streptosporangium)及嗜皮菌屬(Dermatophilus)．

表3 放線菌菌屬鑒定結(jié)果

2．2．3 真菌形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

真菌的基本結(jié)構(gòu)為菌絲和孢子，觀察真菌孢子結(jié)果顯示，大部分真菌孢子為分生孢子，樣品中未分離出酵母菌．共分離真菌7株(見表4)，屬于青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)、根霉屬(Rhizopus)、鐮孢菌屬(Fusarium)及不產(chǎn)孢真菌(Sterile mycelia)．

表4 真菌菌屬鑒定結(jié)果

3 結(jié)束語

土壤微生物是土壤中活躍的因子之一［6］，也是土壤肥力的一個重要部分，施肥制度和施肥方式的不同將會改變土壤微生物的種群數(shù)量、結(jié)構(gòu)和活性進(jìn)而對土壤肥力產(chǎn)生影響［7］．土壤中微生物數(shù)量巨大，繁殖性強(qiáng)，種類繁多，作用機(jī)理復(fù)雜多樣，在土壤生物的地球化學(xué)循環(huán)過程的研究中占有重要的地位［8，9］．土壤的微生物類群中，細(xì)菌數(shù)量最多，放線菌數(shù)量次之，真菌數(shù)量最少．實(shí)驗(yàn)根據(jù)所分離微生物的個體特征、菌落形態(tài)特征及其生理生化特性進(jìn)行初步鑒定．結(jié)果表明，土壤中25株細(xì)菌分別屬于12個不同菌屬;共分離獲得放線菌10株，分別屬于7個不同菌屬;共分離真菌7株，屬于5類不同菌屬．

該實(shí)驗(yàn)旨在研究樣地土壤微生物多樣性，在后續(xù)試驗(yàn)中還將對土壤酶活性、土壤理化性質(zhì)進(jìn)行分析，找出微生物與土壤環(huán)境的互作關(guān)系，再進(jìn)一步探討該互作關(guān)系對作物生長的影響．

［1］ Zhang P J，Zheng J F，Pan G X，et al．Changes in microbial community structure and function within particle size fractions of a paddy soilunderdifferent long-term fertilization treatments from the TaiLake region［J］．Colloids and SurfacesB，2007，58:264-270．

［2］ 鄒莉，袁曉穎，李玲，等．連作對大豆根部土壤微生物的影響研究［J］．微生物學(xué)雜志，2005，25(2)．

［3］ 楊鵬，薛立，陳紅躍，等．不同混交林地土壤養(yǎng)分，酶活性和微生物的研究．湖南林業(yè)科技，2004，31(4)．

［4］ Buchanan RE，et al．伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊:第八版［M］．北京:科學(xué)出版社，2000．

［5］ 張紀(jì)忠．微生物分類學(xué)［M］．北京:復(fù)旦大學(xué)出版社，1990．

［6］ Dong X Z．Manual of Determinative Bacteriology［M］．Beijing:Science Press，2001．

［7］ Abbott L K，Murrphy D V．Soil Biological Fertility［M］．Nether lands:Kluwer Academic Publishers，2003．

［8］ Tied je J M，Asuming-Brem pong S，Nusslein K，et al．Opening the black box of soil microbial diversity［M］．Applied Soil Ecology，1999(13):109-122．

［9］ Girvan M S，Bullimore J，Pretty J N，et al．Soil type is the primary determinant of the composition of the total and active bacterial communities in arable soils［M］．App lied and Enviromental Microbiology，2003，69:1800-1809．