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    紅細(xì)胞生成素對(duì)高糖誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響及其可能機(jī)制

    2014-12-02 03:15:18陳艷霞秦曉華房向東涂衛(wèi)平
    關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)分化高糖腎小管

    陳艷霞,秦曉華,房向東,黃 翀,涂衛(wèi)平

    0 引 言

    糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病全身微血管病變的一部分,是糖尿病的嚴(yán)重慢性并發(fā)癥,已成為終末期腎病的重要原因。既往認(rèn)為DN的主要病變部位在腎小球,但近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)高血糖對(duì)腎小管間質(zhì)損害方面發(fā)揮了更加重要的作用,高糖可介導(dǎo)間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial mesenchymal transition,EMT)的發(fā)生,最終促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生[1]。Rho激酶(ROCK)抑制劑 Y27632和法舒地爾阻斷糖尿病鼠的RhoA/ROCK通路后可改善腎小球的通透性[2]、改善腎血流動(dòng)力學(xué)[3]、改善代謝指標(biāo)及延緩腎小球硬化進(jìn)展[4]、抑制活性氧自由基的形成[5]和減少細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的沉積[6]。這些都意味著RhoA/ROCK信號(hào)通路在DN的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin,EPO)可抑制豬近端腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化,阻止慢性腎疾病的進(jìn)展[7],對(duì)腎損傷具有保護(hù)作用[8],可顯著減輕大鼠體外循環(huán)腎損傷[9],因此本實(shí)驗(yàn)選取高糖誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞(human kidney cells,HK-2)細(xì)胞模擬 DN,并探討EPO對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用,為延緩腎纖維化的進(jìn)展尋找新的證據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑 EPO(沈陽(yáng)三生惠贈(zèng)),DMEM/F12培養(yǎng)基(美國(guó) Hyclone),0.25%胰蛋白酶(美國(guó)Gibco),高糖、甘露醇、ROCK抑制劑Y27632(美國(guó)Sigma),RNA抽提試劑 Trizol(美國(guó) Invitrogen),RT-PCR試劑盒(美國(guó) Fermentas),2×EasyTaq PCR SuperMix(北京全式金),聚合酶鏈反應(yīng)引物由Invitrogen合成,鼠抗人單克隆平滑肌肌動(dòng)蛋白(smooth muscle actin-α,α-SMA)抗體、鼠抗人單克隆E-cadherin抗體、FITC標(biāo)記抗小鼠IgG(北京中杉金橋),人FN定量酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒(上海森雄)。

    1.2 主要儀器 核酸微量蛋白測(cè)定儀、PCR擴(kuò)增儀、凝膠圖像成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad),DYPC-31DN型電泳儀(北京市六一儀器廠),熒光顯微鏡(日本Olym-pus),酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)。

    1.3 HK-2細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 HK-2細(xì)胞株來(lái)源于美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù),由中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院余學(xué)清教授惠贈(zèng)。用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HK-2細(xì)胞,細(xì)胞生長(zhǎng)至70%~80%融合時(shí)傳代入6孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng),至80%融合后改用無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基同步24h。按隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組:空白對(duì)照組、高糖誘導(dǎo)組(高糖終濃度30 mmol/L)、甘露醇對(duì)照組(甘露醇濃度24.5 mmol/L)、EPO對(duì)照組(EPO終濃度為20 U/mL)、5 U/mL EPO干預(yù)組、10 U/mL EPO干預(yù)組、20 U/mL EPO干預(yù)組(干預(yù)組均含高糖30 mmol/L)、ROCK抑制劑(Y27632)組(Y27632終濃度為 30 μmol/L,加入 Y27632 30 min后加高糖,高糖終濃度為30 mmol/L),以上各組均培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.4 RT-PCR檢測(cè) 干預(yù)后培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞,用Trizol分別提取各組細(xì)胞總的RNA,檢測(cè)RNA完整性后用核酸微量蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度。取總 RNA 1.5 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA,取cDNA 2 μL在2×EasyTaq PCR SuperMix的作用下擴(kuò)增目標(biāo)基因(以人β-actin為內(nèi)參照),總反應(yīng)體系50 μL。RhoA的引物序列:正義鏈5'-GGCTGGACTCGGATTCGTTG-3',反 義 鏈 5'-CGTTGGGACAGAAATGCTTGAC-3',擴(kuò)增產(chǎn)物356bp。ROCK1 的引物序列:正義鏈5'-TGATGGCTATTATGGACGAG-3',反義鏈5'-GGAGCGTTTCCCAAGC-3',擴(kuò)增產(chǎn)物293 bp。β-actin的引物序列:正義鏈5'-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3',反義鏈 5'-TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3',擴(kuò)增產(chǎn)物434 bp。反應(yīng)條件:94℃ 預(yù)變性5 min,55℃退火30 s,72℃延伸7 min,共35個(gè)循環(huán)。配制2%瓊脂糖凝膠,PCR產(chǎn)物電泳儀內(nèi)120 V,30 min完成電泳后應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)成像并使用Quantity One軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

    1.5 細(xì)胞免疫熒光 6孔培養(yǎng)板中的細(xì)胞在4℃下用4%多聚甲醛固定20 min,用0.1%Triton穿孔15 min,5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液室溫封閉30 min后各孔中滴加鼠抗人單克隆α-SMA抗體(抗體按1∶200稀釋,5%BSA封閉液配制)或鼠抗人單克隆E-鈣黏蛋白抗體4℃冰箱孵育過(guò)夜后取出室溫恢復(fù)30 min,加入FITC標(biāo)記抗小鼠IgG二抗置37℃孵箱孵育30 min,熒光顯微鏡下觀察。每組細(xì)胞選取10個(gè)視野攝像,熒光圖片用Image-Pro Plus 6.0軟件分析,每個(gè)視野累計(jì)光密度值與測(cè)量面積的比值為平均熒光強(qiáng)度(即蛋白相對(duì)表達(dá)量)。

    1.6 ELISA法檢測(cè)纖連蛋白(fibronectin,F(xiàn)N)收集細(xì)胞上清液后嚴(yán)格按ELISA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作,讀取波長(zhǎng)為450 nm時(shí)的A值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出樣品FN表達(dá)濃度。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組均數(shù)比較用單因素方差分析,兩兩組間比較用LSD法,若方差不齊用秩和檢驗(yàn)。變量間的比較采用Pearson直線相關(guān)分析,以 P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 高糖、EPO 對(duì) RhoAmRNA、ROCK1 mRNA表達(dá)的影響 高糖誘導(dǎo)組RhoA mRNA及ROCK1 mRNA的表達(dá)較空白對(duì)照組明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),EPO干預(yù)組 RhoA mRNA 及ROCK1 mRNA較空白對(duì)照組的表達(dá)顯著減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且與EPO濃度呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。見表1、圖1。

    2.2 RhoA mRNA與ROCK1 mRNA相關(guān)性分析直線相關(guān)分析顯示高糖誘導(dǎo)組,5、10、20 U/mL EPO干預(yù)組RhoA mRNA與ROCK1 mRNA呈正相關(guān)(r=0.907,P=0.046,r=0.899,P=0.041;r=0.862,P=0.021;r=0.832,P=0.007)。

    2.3 高糖、EPO對(duì)α-SMA、E-鈣黏蛋白及FN的蛋白表達(dá)影響 空白對(duì)照組弱表達(dá)α-SMA,高表達(dá)E-鈣黏蛋白;高糖誘導(dǎo)組α-SMA表達(dá)較空白對(duì)照組顯著上升(P<0.05),E-鈣黏蛋白表達(dá)較空白對(duì)照組顯著下降(P<0.05);EPO干預(yù)組及ROCK抑制劑組E-鈣黏蛋白的蛋白表達(dá)較高糖誘導(dǎo)組明顯增加,而α-SMA表達(dá)明顯下降(P<0.05),并且隨EPO濃度的升高作用下降更加顯著。ELISA結(jié)果顯示EPO干預(yù)組及ROCK抑制劑組FN表達(dá)較高糖誘導(dǎo)組顯著下降(P<0.05),且下降程度與EPO濃度相關(guān)。見表2。

    圖1 各組細(xì)胞RhoAmRNA及ROCK1 mRNA的表達(dá)情況Figure 1 The mRNA expressions of RhoA and ROCK1 in different groups

    表1 各組細(xì)胞RhoA mRNA及ROCK1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平(±s)Table 1 The mRNA expressions of RhoA and ROCK1 in different groups(±s)

    表1 各組細(xì)胞RhoA mRNA及ROCK1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平(±s)Table 1 The mRNA expressions of RhoA and ROCK1 in different groups(±s)

    與空白對(duì)照組比較,*P<0.05;與高糖誘導(dǎo)組比較,#P<0.05;與5 U/mL EPO干預(yù)組比較,△P<0.05;與10 U/mL EPO干預(yù)組比較,▲P <0.05

    組別 n 0.945 ±0.131 51.007 ±0.002高糖誘導(dǎo)組 3 1.400 ±0.022*# 1.913 ±0.011*#甘露醇對(duì)照組 3 0.952 ±0.004 1.003 ±0.002 EPO 對(duì)照組 3 0.945 ±0.011 1.004 ±0.002 5 U/mL EPO 干預(yù)組 3 0.278 ±0.006*# 1.418 ±0.006*#10 U/mL EPO干預(yù)組 3 0.770 ±0.005*#△ 0.919 ±0.004*#△20 U/mL EPO干預(yù)組 3 0.334 ±0.009*#△▲ 0.477 ±0.002*#△▲ROCK 抑制劑組 3 1.390±0.002*#△ 0.249±0.005*#△▲RhoA mRNA ROCK1 mRNA空白對(duì)照組3

    表2 各組細(xì)胞α-SMA、E-鈣黏蛋白、FN的蛋白表達(dá)水平(±s)Table 2 The expressions of α-SMA,E-cadherin,F(xiàn)N in different groups(±s)

    表2 各組細(xì)胞α-SMA、E-鈣黏蛋白、FN的蛋白表達(dá)水平(±s)Table 2 The expressions of α-SMA,E-cadherin,F(xiàn)N in different groups(±s)

    與空白對(duì)照組比較,*P<0.05;與10 U/mL EPO干預(yù)組比較,#P<0.05;與高糖誘導(dǎo)組比較,△P<0.05;與5 U/mL EPO干預(yù)組比較,▲P <0.05

    組別 n α-SMA E-鈣黏蛋白 FN(ng/mL)0.224 ±0.006 0.644 ±0.006 2582.50 ±87.20高糖誘導(dǎo)組 3 0.335 ±0.006* 0.107 ±0.004* 14545.53 ±317.27*甘露醇對(duì)照組 3 0.223 ±0.082 0.645 ±0.006 2434.63 ±198.76 EPO 對(duì)照組 3 0.225 ±0.006 0.645 ±0.008 2512.97 ±205.27 5 U/mL EPO 干預(yù)組 3 0.285±0.005*△ 0.236±0.006*△▲ 11273.73±597.17*△▲10 U/mL EPO干預(yù)組 3 0.273±0.007*△▲ 0.433±0.010*△▲ 6690.70±380.76*△▲20 U/mL EPO干預(yù)組 3 0.243±0.006*#△▲ 0.521±0.010*#△▲ 5252.70 ±179.23*#△▲ROCK 抑制劑組 3 0.235±0.006*#△▲ 0.357±0.006*#△▲ 3252.13±197.08*#△▲空白對(duì)照組3

    3 討 論

    傳統(tǒng)觀念認(rèn)為,DN是由于血流動(dòng)力學(xué)及代謝因素引起的,現(xiàn)在越來(lái)越多的證據(jù)支持,慢性微炎癥狀態(tài)及免疫系統(tǒng)的激活也是DN的發(fā)病機(jī)制之一[10]。EPO是一種多功能的細(xì)胞因子,不僅具有促進(jìn)紅細(xì)胞生成的作用,同時(shí)還有抗凋亡[11]及免疫調(diào)節(jié)作用[12]。對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型的研究發(fā)現(xiàn),EPO還具有抗炎的作用[13]。在DN中,高糖主要是通過(guò)刺激某些細(xì)胞因子產(chǎn)生和促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成而發(fā)揮效應(yīng),進(jìn)而發(fā)生EMT。EMT的主要特點(diǎn)是具有上皮細(xì)胞標(biāo)志的E-鈣黏蛋白丟失和間充質(zhì)特征的α-SMA、間質(zhì)基質(zhì)組分如FN的表達(dá)。Patel等[14]也證實(shí)在 EMT過(guò)程中,Rho的激活是一個(gè)關(guān)鍵性的步驟。Brownlee等[15]提出細(xì)胞對(duì)葡萄糖-誘導(dǎo)毒性的敏感性依賴于其吸收機(jī)制及高糖環(huán)境下的調(diào)節(jié)能力。然而腎小管上皮細(xì)胞無(wú)法減少葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)從而減少細(xì)胞在高糖環(huán)境下發(fā)生的形態(tài)及功能的改變。腎小管上皮細(xì)胞吸收葡萄糖是不受胰島素水平調(diào)節(jié)的,因此,在高糖環(huán)境下,腎小管上皮細(xì)胞對(duì)葡萄糖水平更敏感。本實(shí)驗(yàn)以高糖培養(yǎng)HK-2細(xì)胞模擬DN模型,探討紅細(xì)胞生成素對(duì)高糖誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響。本研究證實(shí)高糖可通過(guò)RhoA/ROCK信號(hào)通路引起腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化,給予RhoA/ROCK信號(hào)通路抑制劑Y27632后腎纖維化指標(biāo)發(fā)生顯著改變,高糖誘導(dǎo)組熒光結(jié)果顯示E-鈣黏蛋白表達(dá)顯著下降,α-SMA的蛋白表達(dá)顯著上升,ELISA結(jié)果亦提示細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分FN的蛋白表達(dá)明顯增多,我們的研究表明,高糖可誘導(dǎo) HK-2細(xì)胞發(fā)生 EMT并激活RhoA/ROCK信號(hào)通路,RhoA/ROCK通路參與高糖誘導(dǎo)的EMT,與Gu等[16]研究結(jié)果一致。給予EPO干預(yù)后,E-鈣黏蛋白表達(dá)相對(duì)增多,α-SMA的蛋白表達(dá)相對(duì)減少,F(xiàn)N表達(dá)相對(duì)減少,說(shuō)明給予EPO干預(yù)后減輕了EMT過(guò)程,從而顯示出EPO對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程具有保護(hù)作用。Person直線相關(guān)分析顯示高糖誘導(dǎo)組及EPO干預(yù)組RhoA mRNA與ROCK1 mRNA呈正相關(guān),推測(cè)其保護(hù)作用與RhoA/ROCK通路有關(guān)。因本實(shí)驗(yàn)顯示,給予高糖刺激后,RhoA mRNA及ROCK mRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng),加入EPO干預(yù)后,其表達(dá)隨EPO濃度的增加而逐漸減弱。EPO通過(guò)RhoA/ROCK通路發(fā)揮保護(hù)作用的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究,可能與EPO的抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。

    本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了EPO可抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化,從而延緩腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程,為DN患者的治療帶來(lái)新的希望。然而目前國(guó)內(nèi)外研究對(duì)DN患者EPO延緩腎纖維化作用在臨床上使用的量及使用時(shí)間等問(wèn)題均未有明確的觀點(diǎn)。EPO的潛在毒性作用如高血壓、充血性心力衰竭、血栓甚至可能阻滯腫瘤細(xì)胞的凋亡等也限制其在臨床的使用[17]。相信隨著EPO研究的不斷深入,EPO對(duì)DN患者的治療作用指日可待。

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