腸三葉因子對胃黏膜上皮細(xì)胞增殖的影響及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究

孫兆瑞，楊志洲，林金鋒，邵旦兵，劉紅梅，徐 敏，張 煒，孫寶迪，任 藝，邵斌霞，許寶華，唐文杰，聶時(shí)南

0 引 言

腸三葉因子(intestinal trefoil factor，ITF)屬于三葉肽家族(trefoil factor family，TFF)，是一種小分子多肽物質(zhì)，主要在小腸及結(jié)腸杯狀細(xì)胞、胃竇黏膜中表達(dá)，具有重要的胃腸道黏膜保護(hù)和修復(fù)作用［1-5］。ITF具有較強(qiáng)的細(xì)胞保護(hù)作用，可促進(jìn)胃腸道黏膜上皮細(xì)胞增殖遷移，減輕多種損傷因子介導(dǎo)的黏膜損害，抑制細(xì)胞凋亡，因而在胃腸道自我保護(hù)機(jī)制中具有重要作用［6］。盡管目前對ITF生理功能和理化性質(zhì)的研究較為深入，但其引起胃黏膜上皮細(xì)胞增殖的具體分子機(jī)制尚未闡明，特別是有關(guān)ITF發(fā)揮作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制報(bào)道較少。本文主要以體外培養(yǎng)的胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1為模型，觀察ITF對胃年膜上皮細(xì)胞增殖作用的影響，并初步探討ITF促進(jìn)增殖的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制與PI3K/Akt在胃黏膜上皮細(xì)胞生理過程中的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 GES-1系購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。FBS、DMEM高糖培養(yǎng)基(美國 GIBCO公司)，ITF(美國 PeproTech 公司)，p-Akt、Akt抗體、LY294002(美國 Cell Signaling Technology公司)，β-actin抗體(英國Abcam公司)，CCK-8試劑盒(日本Dojindo公司)。

1.2 GES-1細(xì)胞的培養(yǎng) 無菌條件下用含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基(加入1%L-谷氨酰胺、1%青鏈霉素)培養(yǎng)GES-1，以1×106個(gè)/mL的密度接種于100 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，恒溫培養(yǎng)，每3天換液1次，直至細(xì)胞生長至80%融合。0.25%胰酶-EDTA消化細(xì)胞，以1∶2的比例傳代。倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司)下觀察細(xì)胞的生長情況。

1.3 不同濃度ITF對GES-1細(xì)胞增殖活力的影響以2×105個(gè)GES-1細(xì)胞的密度接種于96孔板，每孔加100μL細(xì)胞培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至貼壁完全。分別加入不同濃度的ITF進(jìn)行培養(yǎng)，并形成ITF低濃度組(100 ng/mL)與ITF高濃度組(500 ng/mL)，另設(shè)未處理GES-1細(xì)胞為空白對照組。3組細(xì)胞分別持續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后吸去培養(yǎng)基，PBS洗 2遍，以無血清DMEM高糖培養(yǎng)基∶CCK-8=10∶1的比例混勻，每孔加入100μL，37℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2h，采用Microplate reader酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞在波長450nm的A值。采集數(shù)據(jù)并使用Origin 7.5軟件進(jìn)行作圖。

1.4 PI3K/Akt信號通路抑制劑 LY294002對GES-1細(xì)胞增殖活力的影響 以2×105個(gè)GES-1細(xì)胞的密度接種于96孔板，每孔加100蘈細(xì)胞培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至貼壁完全。將培養(yǎng)后的細(xì)胞分為4份，其中1份未做處理(空白對照組)、2份加入100 ng/mL ITF(ITF 組)、15 μmol/L LY294002(LY 組)，另1 份分別加入 100 ng/mL ITF 和 15 μmol/L LY294002(ITF+LY294002 組)。持續(xù)培養(yǎng) 24 h、48 h、72 h 后，光鏡下觀察4組GES-1細(xì)胞生長狀態(tài)。然后吸去培養(yǎng)基，PBS洗2遍，以無血清DMEM高糖培養(yǎng)基∶CCK-8=10∶1 的比例混勻，每孔加入 100 μL，37 ℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，采用Microplate reader酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞在波長450nm的A值。采集數(shù)據(jù)使用Origin 7.5軟件進(jìn)行作圖。

1.5 Western blot技術(shù)檢測PI3K/Akt信號通路蛋白的表達(dá)情況 GES-1細(xì)胞接種于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中。待細(xì)胞貼壁后，加入100ng/mL的ITF，分別于處理 0、5、10、15、30、60、120 min 后提取細(xì)胞蛋白，Western blot檢測p-Akt和Akt蛋白表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)分組方法同1.4。分別提取4組細(xì)胞蛋白進(jìn)行Western blot分子實(shí)驗(yàn)，檢測p-Akt和Akt蛋白表達(dá)情況。

1.5.1 細(xì)胞蛋白提取過程 取出培養(yǎng)皿，培養(yǎng)的細(xì)胞棄上清后用冰冷PBS洗滌2次，每孔加入300 μL RIPA 裂解液(50 mmol/L Tris-HCl pH=7.4、150 mmol/L NaCl、1%NP-40、0.1%SDS、1 × 蛋白酶抑制劑)，用刮刀刮下細(xì)胞后收集于離心管中，冰上裂解30 min。以13 800×g離心力離心30 min，取上清，測定上清體積。從上清中取5 μL用PBS稀釋10倍，采用Bradford法測定蛋白濃度，將各樣品調(diào)至等濃度。按樣品∶凝膠加樣緩沖液=4∶1的比例加入5×凝膠加樣緩沖液(50%甘油、250 mmol/L、pH=6.8 Tris-HCl、10% 巰基乙醇、0.25% 溴酚藍(lán)、10%SDS)。90℃水浴10min，分裝后凍存于-80℃。

1.5.2 Western blot過程 每個(gè)樣本取等量蛋白(約50 μg)進(jìn)行 SDS-PAGE 凝膠電泳，電壓 100 V、100 min。電泳后，電泳凝膠放入半干轉(zhuǎn)膜槽內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，設(shè)定電壓為20 V、時(shí)間10 min，將蛋白條帶轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。轉(zhuǎn)膜后，PBS漂洗膜3次，5 min/次。取出膜，放于封閉液(含3%脫脂奶粉和0.3%BSA)中，37 ℃ 封閉 2 h。PBST(含 0.05%Tween 20的PBS)漂洗1次，5 min/次。將膜按照相對分子質(zhì)量裁成小條，加入多克隆兔/鼠抗 p-Akt、Akt、β-actin抗體(1∶3000)，4℃孵育過夜后用適量PBST漂洗6次，6 min/次。將膜又分別浸入1∶10 000的帶HRP標(biāo)記的羊抗兔/鼠二抗，室溫孵育1h后用適量PBST漂洗6次，5 min/次。ECL顯色。FluorChem FC2化學(xué)發(fā)光/熒光/可見光凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集，并分析圖片。采用Image J軟件(version 1.41)對條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0軟件處理數(shù)據(jù)，Origin 7.5軟件進(jìn)行作圖。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。多組均數(shù)比較用單因素方差分析。組間兩兩比較采用LSD法。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度ITF對GES-1細(xì)胞增殖活力的影響采用CCK-8試劑盒檢測不同濃度ITF對GES-1細(xì)胞增殖活力的影響。與空白對照組比較，經(jīng)過ITF處理的GES-1細(xì)胞增殖活力顯著升高(P＜0.05)，見圖1。不同濃度的ITF對GES-1細(xì)胞的增殖影響存在差別，促進(jìn)GES-1細(xì)胞增殖的能力隨ITF濃度越高而加強(qiáng)。

2.2 Western blot檢測 ITF刺激后 PI3K/Akt信號通路的表達(dá)情況 采用Western blot技術(shù)檢測ITF處理GES-1細(xì)胞后，PI3K/Akt信號通路中關(guān)鍵蛋白p-Akt、Akt蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，ITF刺激5 min后，與空白對照組比較，p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯上升(P＜0.01);ITF刺激30min左右表達(dá)水平達(dá)到最高，并可維持高水平表達(dá)至60 min;之后表達(dá)水平逐漸下降;120 min后p-Akt表達(dá)水平降至與空白對照組接近。Akt蛋白表達(dá)水平在ITF刺激處理后始終保持不變。見圖2。Western blot結(jié)果說明ITF通過激活PI3K/Akt信號通路促進(jìn)GES-1細(xì)胞的增殖。

2.3 光鏡下觀察ITF和LY294002對GES-1細(xì)胞增殖的影響 同一密度接種的GES-1細(xì)胞經(jīng)ITF和LY294002處理3 d后顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比較，ITF組明顯促進(jìn)了GES-1細(xì)胞的增殖，細(xì)胞密度明顯增加。而采用PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002處理后，ITF刺激的細(xì)胞增殖速度明顯減弱，細(xì)胞密度較ITF組明顯降低。經(jīng)LY294002單獨(dú)處理的GES-1細(xì)胞增殖速度最慢、密度最低。見圖3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明PI3K/Akt信號通路參與調(diào)控GES-1細(xì)胞的增殖。

2.4 PI3K/Akt信號通路對GES-1細(xì)胞增殖的調(diào)控作用 采用CCK-8試劑盒檢測PI3K/Akt信號通路對GES-1細(xì)胞增殖活力的影響發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，經(jīng)過ITF處理的GES-1細(xì)胞增殖活力顯著升高(P＜0.01);而LY294002能夠明顯抑制ITF的作用效果，與ITF組相比較，ITF+LY294002組GES-1細(xì)胞增殖活力明顯下降(P＜0.01)，且隨著時(shí)間的延長，LY294002的抑制作用越明顯，見圖4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明LY294002通過抑制PI3K/Akt信號通路能夠阻斷ITF的促增殖作用，PI3K/Akt信號通路是ITF促進(jìn)GES-1細(xì)胞增殖的主要分子機(jī)制。

圖1 各組細(xì)胞不同時(shí)間A值比較Figure 1 Comparation of absorbance in each group

圖2 Western blot檢測ITF刺激GES-1細(xì)胞后PI3K/Akt信號通路的表達(dá)情況對比Figure 2 Effects of ITF on the PI3K/Akt signaling pathway of GES-1 cells detect by Western blot

圖3 GES-1細(xì)胞加入ITF和LY294002后光鏡下觀察GES-1細(xì)胞的增殖情況Figure 3 Effects of ITF and LY294002 on the proliferation of GES-1 cells detect by light microscope

2.5 Western blot檢測 PI3K/Akt信號通路的表達(dá)情況 采用Western blot技術(shù)檢測ITF和LY294002處理GES-1細(xì)胞后，PI3K/Akt信號通路中關(guān)鍵蛋白p-Akt、Akt蛋白的表達(dá)情況。ITF刺激后與空白對照組相比較，p-Akt蛋白表達(dá)水平顯著升高(P＜0.01)，而在加入PI3K抑制劑LY294002處理后，ITF激活的p-Akt表達(dá)明顯受到抑制(P＜0.01)，其表達(dá)水平顯著下降，p-Akt表達(dá)降至較低水平。見圖5。Western blot結(jié)果說明ITF通過激活PI3K/Akt信號通路參與調(diào)控GES-1細(xì)胞的增殖。

圖4 不同時(shí)間各組GES-1細(xì)胞分別加入ITF和LY294002處理增殖活力比較Figure 4 Effects of ITF and LY294002 on the proliferation of GES-1 cells detect by CCK-8

圖5 Western blot檢測ITF和LY294002分別處理GES-1細(xì)胞后PI3K/Akt信號通路的表達(dá)比較Figure 5 Effects of ITF and LY294002 on the P13K/Akt signaling pathway of GES-1 cells detect by Western blot

3 討 論

患者在遭受各類嚴(yán)重創(chuàng)傷(包括大手術(shù))、燒傷、顱腦外傷、危重疾病和其他應(yīng)激情況下，會出現(xiàn)胃、十二指腸黏膜的急性病變，主要表現(xiàn)為胃、十二指腸黏膜的糜爛、潰瘍、滲血、黏膜上皮凋亡脫落等，可導(dǎo)致原有病情惡化［6-7］。胃潰瘍的發(fā)病機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，既與整體因素如神經(jīng)-內(nèi)分泌失調(diào)有關(guān)，又與局部因素如胃黏膜屏障保護(hù)功能削弱和損傷因素作用相對增強(qiáng)有關(guān)，是多因素綜合作用的結(jié)果［8-9］。其中，胃黏膜上皮屏障的破壞是胃潰瘍發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。多種因素導(dǎo)致胃潰瘍發(fā)生時(shí)，各類損傷因素會導(dǎo)致胃黏膜上皮組織發(fā)生損傷凋亡，使得黏膜上皮屏障功能障礙，繼而引發(fā)應(yīng)激性潰瘍的發(fā)生發(fā)展。因此，對胃黏膜上皮組織結(jié)構(gòu)的保護(hù)和功能恢復(fù)對于治療應(yīng)激性潰瘍至關(guān)重要。如何促進(jìn)胃黏膜上皮細(xì)胞增殖、修復(fù)上皮組織完整性并恢復(fù)上皮屏障功能是治療應(yīng)激性潰瘍的關(guān)鍵。

近年多項(xiàng)研究表明，TFF是在胃腸道黏膜病變損傷中對胃腸道黏膜保護(hù)作用十分重要的一類蛋白質(zhì)多肽［10-14］。而作為 TFF家族重要的一員，ITF，因其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、緊密，具有抗酸、抗蛋白酶和抗熱分解的生物學(xué)特性，因而在消化道內(nèi)能保持結(jié)構(gòu)及功能上的完整，逐漸受到研究人員的廣泛關(guān)注［15］。目前“基因重組TFF3”已被批準(zhǔn)為國家一類新藥，其治療適應(yīng)證為修復(fù)黏膜上皮組織、預(yù)防與治療胃腸道潰瘍及炎癥。有研究報(bào)道表明，ITF參與了胃腸道潰瘍中黏膜保護(hù)、創(chuàng)傷修復(fù)［16］、黏膜上皮細(xì)胞遷移［17］、細(xì)胞凋亡調(diào)控［18］和血管生成［19］等重要的生物學(xué)過程，發(fā)揮對胃腸道的保護(hù)作用。本研究探討了重組ITF對胃黏膜上皮細(xì)胞的增殖作用的影響，并探討其作用的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)中，通過CCK-8檢測ITF作用胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1后，增殖活力的變化情況。結(jié)果表明，在ITF刺激下，GES-1細(xì)胞增殖活力明顯增強(qiáng)，且隨著ITF濃度的升高，其增殖活力亦越強(qiáng)。隨著ITF作用時(shí)間的延長，GES-1始終處于增殖狀態(tài)，增殖活力變化較為明顯。然而，目前關(guān)于ITF促進(jìn)胃年膜上皮細(xì)胞增殖的分子機(jī)制尚缺乏深入研究，ITF作用的具體分子機(jī)制尚不十分明確。

研究表明，PI3K/Akt信號通路與細(xì)胞的生命活動密切相關(guān)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡、增生、遷移、分化和代謝［20-21］。除此之外，PI3K/Akt信號通路還參與胃黏膜上皮重建、促進(jìn)胃部腫瘤的發(fā)生發(fā)展［22］。研究已證明ITF的抗凋亡作用不是直接作用于凋亡信號分子(如fas、bcl-2)，而是阻斷與 EGFR和 PI3K/Akt有關(guān)的p53依賴或非依賴的細(xì)胞凋亡［23］。另有研究發(fā)現(xiàn)，ITF通過PI3K/Akt/NF-κB途徑阻斷上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)錨定蛋白(anoikis)［24］。而對于ITF促進(jìn)GES-1細(xì)胞的增殖與PI3K/Akt信號通路的相關(guān)性研究在本實(shí)驗(yàn)中有所體現(xiàn)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在ITF刺激GES-1細(xì)胞5 min后，Akt蛋白發(fā)生磷酸化;刺激30min時(shí)達(dá)到峰值，隨后開始下降;120 min時(shí)已恢復(fù)正常水平，證明ITF能夠激活GES-1細(xì)胞的PI3K/Akt信號通路，從而促進(jìn)胃黏膜上皮細(xì)胞的增殖。利用PI3K/Akt信號通路的特異性抑制劑LY294002處理GES-1細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在LY294002的作用下，通過CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)ITF對GES-1細(xì)胞的促增殖作用明顯受到了抑制。Western blot結(jié)果表明，在LY294002作用后，ITF激活的p-Akt水平表達(dá)下降，證明PI3K/Akt信號通路受到抑制。以上結(jié)果證明，PI3K/Akt信號通路是參與ITF促進(jìn)GES-1細(xì)胞增殖的主要信號通路。

本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，ITF可以通過激活PI3K/Akt信號通路促進(jìn)胃黏膜上皮細(xì)胞的增殖，PI3K/Akt信號通路是ITF發(fā)揮促增殖作用的主要分子機(jī)制。然而，關(guān)于在PI3K/Akt信號通路中相關(guān)蛋白的激活情況，以及其他下游參與ITF信號傳遞的信號通路尚有待進(jìn)一步研究。

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