靶向EphB4的慢病毒干擾載體對結(jié)腸癌細胞中EphB4及EphrinB2表達的影響

張 錦，夏秋媛，王建東，周曉軍

0 引 言

促紅細胞生成素產(chǎn)生肝細胞(Erythropoietinproducing hepatocyte receptor，Eph)受體是酪氨酸蛋白激酶受體家族中最大的亞家族，Ephrin是其配體，兩者均為膜結(jié)合蛋白，相互依賴進行信號轉(zhuǎn)導。研究顯示Eph的失調(diào)能導致多種細胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生［1-4］。EphB4是Eph家族中最為重要的成員之一，通過配體EphrinB2被激活，進而在各種組織的發(fā)育、成熟及腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮其重要而獨特的作用［5］。但EphB4在不同類型腫瘤組織中的功能存在較大差異，甚至在同種類型腫瘤中，有關EphB4的研究也呈現(xiàn)完全相反的結(jié)論［6］。前期實驗中，我們通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)高表達EphB4的結(jié)腸癌組織中EphrinB2的含量并非全部呈現(xiàn)低表達的狀態(tài)，提示EphB4發(fā)揮功能可能并非絕對依賴于EphrinB2的結(jié)合，EphB4和EphrinB2兩者之間的相互作用可能受到了多種因素的調(diào)控，其相關機制的復雜性需要更進一步探討。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是近年來廣泛應用的一種抑制基因表達及研究基因功能的有效方法，其中最常用的是轉(zhuǎn)錄短發(fā)卡 RNA(short hairpin RNA，shRNA)。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA同樣可通過RNAi途徑降解靶mRNA，對內(nèi)源基因的表達進行調(diào)控，與目前 RNAi過程中最常用的shRNA相比，miRNA利用的是聚合酶II表達體系，因此在進行基因干擾時miRNA比傳統(tǒng)的shRNA更為有效，并具有可調(diào)控的優(yōu)點［7-8］。為了更好地研究EphB4基因在消化系統(tǒng)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，本研究通過慢病毒介導的RNAi技術干擾結(jié)腸癌細胞株SW480及Caco-2中EphB4基因的表達，并觀察EphB4 mRNA的表達變化對其配體EphrinB2的影響，為后續(xù)深入研究結(jié)腸癌中EphB4基因的具體功能及相關機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 miRNA表達載體 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR、慢病毒載體pLenti6.3/V5-DEST、感受態(tài)細胞DH5α、Stbl3、HEK293、293FT、lipofectamine 2000、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Opti-MEM培養(yǎng)基、0.05%Trypsin、HQ高純度質(zhì)粒抽提試劑盒、Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNase H、Axygen PCR產(chǎn)物純化試劑盒;BP clonaseⅡ、LR clonaseⅡ、蛋白酶 K、pDONR221等均購自Invitrogen公司;EagⅠ購自NEB公司;氨芐青霉素溶液、奇霉素購自上海捷瑞生物公司;氯仿、無水乙醇等均為化學純級，購自南京化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組EphB4 miRNA干擾載體的構(gòu)建與鑒定根據(jù)GenBank中人EphB4 mRNA序列(NM_004444.4)，參考 miRNA設計原則，通過 Invitrogen網(wǎng)站上的專用設計軟件www.invitrogen.com/rnai設計并經(jīng)BLAST序列比對軟件進行同源性分析，從中篩選出3對編碼EphB4 miRNA的單鏈寡核苷酸(oligo)序列和1對陰性對照oligo序列，交由Invitrogen公司合成。將上述合成好的oligo序列退火成雙鏈并稀釋成10 nmol/L后，將4 μL雙鏈miRNA oligo與1μL T4 DNA ligase(1U/μL)混勻，分別連接到載體pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR構(gòu)建miRNA表達質(zhì)粒。取10 μL上述連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5α，并于含有50 μg/mL奇霉素抗性 LB平板上37℃孵育，提取無內(nèi)毒素超純質(zhì)粒進行測序鑒定，以驗證重組克隆中插入的片段序列是否與設計的oligo序列一致。見表1。

表1 設計的oligo DNA序列Table 1 Sequences of the oligo DNA

1.2.2 干擾質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細胞 HEK293細胞常規(guī)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中。將狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的HEK293細胞用0.25%胰酶消化，并用完全培養(yǎng)基制備單細胞懸液。細胞計數(shù)后，按照5×105個/孔接種于6孔板中培養(yǎng)過夜。分別用250 μL Opti-MEM稀釋各組質(zhì)粒(3 μg)和lipofectamine 2000(10 μL)，輕輕混合已稀釋的質(zhì)粒和lipofectamine 2000，室溫孵育20 min使兩者充分反應形成脂質(zhì)體-質(zhì)粒復合物。在各孔HEK293細胞覆蓋率80%左右時，依次緩慢加入500 μL上述復合物并輕輕混勻。各組細胞分別置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h后，更換完全培養(yǎng)基(不含抗生素)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，熒光顯微鏡下觀察各組細胞綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表達情況。

1.2.3 qPCR法檢測各干擾載體對靶基因的干擾效果 細胞瞬時轉(zhuǎn)染48 h后，Trizol法提取各組細胞樣品中總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。操作按說明書進行。通過qPCR法檢測細胞樣品中目的基因EphB4、EphrinB2和內(nèi)參基因GAPDH的表達量，實驗重復3次。根據(jù)qPCR反應曲線得到各樣品目的基因和內(nèi)參基因的域值循環(huán)數(shù)(threshold cycle number，ct值)，采用ΔΔct的方法對基因表達進行相對定量。以轉(zhuǎn)染陰性對照載體的樣品作為對照樣品，比較各瞬時轉(zhuǎn)染干擾載體組樣品中目的基因的表達量，并計算干擾效果。計算公式如下:

ΔΔct=(待測樣品目的基因的ct平均值-待測樣品內(nèi)參基因的ct平均值)-(對照樣品目的基因的ct平均值-對照樣本內(nèi)參基因的ct平均值)

基因表達量 F=2-ΔΔct

目的基因干擾效率=1-2-ΔΔct

引物序列如下:EphB4-上游引物:5'-CGCACCTACGAAGTGTGTGA-3'，EphB4-下 游 引 物:5'-GTCCGCATCGCTCTCATAGTA-3';EphrinB2-上游引物:5'-TATGCAGAACTGCGATTTCCAA-3'，EphrinB2-下游引物:5'-TGGGTATAGTACCAGTCCTTGTC-3';GAPDH-上游引物:5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3'，GAPDH-下 游 引 物:5'-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3'。PCR反應條件為95℃ 2 min;95℃ 10 s，60℃ 30 s，70℃ 45s，40 個循環(huán);95℃ 30s。

1.2.4 慢病毒載體構(gòu)建 通過BP、LR反應先后將線性化的miRNA表達載體與中間載體pDONR221及pLenti6/V5-DEST連接，構(gòu)建慢病毒表達載體，同時構(gòu)建含有陰性對照質(zhì)粒的慢病毒載體，轉(zhuǎn)化Stb13感受態(tài)細胞。通過氨芐青霉素抗性篩選陽性克隆，大量擴增，并進行測序驗證。

1.2.5 慢病毒包裝 取9 μg Packaging Mix和3 μg慢病毒表達質(zhì)粒pLenti6/V5-DEST-miR-EphB4加入1.5 mL Opti-MEM，輕輕混勻后加入 lipofectamine 2000稀釋液，室溫孵育20 min制備質(zhì)粒脂質(zhì)體復合物，并緩慢加入293FT細胞，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，更換為完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞培養(yǎng)液上清，離心并過濾。將所獲病毒液命名為Lenti-miR-EphB4并進行滴度測定。

1.2.6 病毒滴度的測定 HEK293細胞經(jīng)胰酶消化后輕輕吹打成單細胞懸液，細胞計數(shù)后按8000個/孔的密度鋪于96孔板。病毒液用慢病毒稀釋用培養(yǎng)基(DMEM+2%FBS+8μg/mLPolybrene)進行1∶10稀釋后，各取100μL感染96孔板中的HEK293細胞。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，更換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)96 h，在熒光顯微鏡下觀察各孔中熒光細胞數(shù)量，每個稀釋度2個重復。公式如下:

病毒滴度=各孔中表達熒光的細胞數(shù)量平均值/每孔中含有的慢病毒液體積

1.2.7 慢病毒浸染靶細胞構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株 靶細胞經(jīng)胰酶消化、細胞計數(shù)后按照每孔1.5×105個細胞接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，換成不含血清的培養(yǎng)基，分別加入慢病毒Lenti-miR-EphB4和Lenti-EGFP(陰性對照)稀釋液繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后于熒光顯微鏡下觀察GFP的表達情況，并加入一定濃度的Blasticidin進行篩選，72 h后觀察細胞情況，后續(xù)每4～72 h更換1次含有抗生素Blasticidin的完全培養(yǎng)基。待空白孔細胞完全死亡后，繼續(xù)培養(yǎng)并適時凍存，同時收集部分細胞抽提RNA檢測EphB4及EphrinB2 mRNA表達。設定空白的靶細胞作為對照。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 11.5軟件進行數(shù)據(jù)分析，定量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，以 P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定 將各組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5α后，各重組質(zhì)粒測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對后顯示插入的片段序列與設計合成的編碼序列完全一致，表明 miRNA表達載體 SR-1、SR-2、SR-3全部構(gòu)建成功。見圖1。

圖1 重組EphB4 miRNA干擾載體SR-1和SR-2及SR-3單向測序結(jié)果Figure 1 Results of sequencing with recombinant plasmids SR-1，SR-2 and SR-3

2.2 各干擾載體在HEK293細胞中干擾效果的評價 miRNA表達載體SR-1、SR-2、SR-3及陰性對照載體SR-neg瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細胞24 h后，熒光顯微鏡下觀察各組細胞中均見GFP表達。見圖2。qPCR檢測證實經(jīng)過干擾質(zhì)粒SR-1～3及陰性對照質(zhì)粒SR-neg處理后，HEK293細胞中靶基因EphB4的干擾效率分別為 0.10、0.24、0.51 和0。

2.3 慢病毒的包裝及滴度測定 慢病毒表達載體pLenti6.3/V5-DEST-miR-EphB4經(jīng)測序驗證無誤，將其與包裝質(zhì)粒pLP1、pLP2及pLP/VSVG通過脂質(zhì)體介導獲得了含有EphB4基因干擾序列的慢病毒Lenti-miR-EphB4。通過稀釋計數(shù)法測得病毒滴度為7×108TU/mL。

2.4 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的獲得 病毒液Lenti-miR-EphB4和Lenti-EGFP浸染靶細胞SW480及Caco-2后，根據(jù)本實驗所用的慢病毒載體中所含的抗性標志選用藥物Blasticidin對靶細胞進行篩選及維持，最終獲得了穩(wěn)定的細胞系。熒光顯微鏡下觀察病毒轉(zhuǎn)染后72 h各組細胞均可見GFP表達。見圖3。

圖2 熒光顯微鏡下各干擾載體瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細胞后GFP表達Figure 2 HEK293 cells transfected with recombinant plasmidsSR-1，SR-2，SR-3 and SR-neg expressing GFP

2.5 穩(wěn)轉(zhuǎn)株中EphB4及EphrinB2的表達 LentimiR-EphB4浸染后，SW480和Caco-2中EphB4 mRNA相對表達量(0.49 ±0.02、0.62 ±0.04)均較原始SW480(1.00 ±0.00)和 Caco-2 降低(1.00 ±0.00)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000);SW480中EphrinB2 mRNA 表達量F(2.11±0.04)較原始 SW480(1.00 ±0.00)明顯升高(P=0.000);而 Caco-2 細胞中 EphrinB2 mRNA表達與原始Caco-2細胞的差異無統(tǒng)計學意義(P=0.315)。慢病毒Lenti-EGFP浸染的結(jié)腸癌細胞中EphB4和EphrinB2 mRNA相對表達量F均無明顯改變(P ＞0.05)。

圖3 熒光顯微鏡下慢病毒轉(zhuǎn)染后的GFP表達Figure 3 Cell lines SW480 and Caco-2 after transfection with recombinant lentiviruses Lenti-miR-EphB4 or Lenti-EGFP expressing GFP

3 討 論

EphB4是Eph家族成員中研究最為廣泛的因子之一。有研究指出EphB4高表達能夠促進胃癌、肺癌、乳腺癌浸潤轉(zhuǎn)移［6］，亦有報道顯示EphB4在結(jié)腸癌中起著抑癌基因的作用，EphB4表達丟失或降低常常預示著患者生存時間較短［9］。盡管研究顯示EphB4與其配體EphrinB2結(jié)合后在腫瘤病理性血管生成中發(fā)揮重要作用［10］，但兩者的表達并非呈現(xiàn)絕對的負相關，EphB4發(fā)揮作用是否存在EphrinB2依賴性與EphrinB2非依賴性2種途徑還有待驗證。雖然現(xiàn)有研究結(jié)論存在較大分歧，但上述研究均表明EphB4對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展，特別是腫瘤血管生成及基因靶向治療具有格外重要的意義［11］，EphB4功能的多樣性、機制的復雜性都有待進一步研究，以此為臨床靶向EphB4的抗腫瘤治療提供有力的實驗依據(jù)。而近些年RNAi技術的運用，使得對特定基因具體功能和作用機制進行深入細致的研究成為可能［12-13］。

研究發(fā)現(xiàn)，與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相比，本實驗選用的慢病毒載體能夠轉(zhuǎn)移大容量的基因片段，并使其穩(wěn)定整合于靶細胞的基因組且不易誘發(fā)宿主免疫反應;同時慢病毒在整合基因時，并不傾向于轉(zhuǎn)錄的起始位點，而是在基因的整個轉(zhuǎn)錄區(qū)都可以整合，整合的慢病毒對啟動子的激活概率更低。與其他致癌反轉(zhuǎn)錄病毒載體相比，慢病毒載體不易引起插入突變［14］。因此慢病毒載體不僅為基因功能及機制的實驗研究提供了技術保障，同時也為日后臨床上基因靶向治療的實現(xiàn)提供了可能［15］。為了優(yōu)化構(gòu)建的靶向EphB4基因的慢病毒表達載體，本實驗首先針對該基因設計合成了多對干擾序列，并通過質(zhì)粒包裝瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細胞，篩選出干擾效率最高的序列進行后續(xù)慢病毒載體構(gòu)建。熒光顯微鏡下各組細胞均可見GFP表達，表明瞬時轉(zhuǎn)染成功。同時qPCR證實干擾質(zhì)粒SR-3的干擾效率最高。此后我們對篩選出的SR-3質(zhì)粒進行了慢病毒表達載體構(gòu)建及病毒包裝，通過基因測序分析構(gòu)建的慢病毒載體未產(chǎn)生堿基突變，構(gòu)建成功。將獲得的包含EphB4基因干擾序列的慢病毒Lenti-miR-EphB4及包含陰性對照序列的慢病毒lenti-EGFP浸染結(jié)腸癌細胞株72 h后，通過熒光顯微鏡觀察GFP表達情況證實干擾成功，qPCR進一步證實Lenti-miR-EphB4成功干擾了結(jié)腸癌細胞株SW480和 Caco-2中EphB4的表達，與原始細胞相比，干擾細胞中EphB4 mRNA含量顯著降低，且轉(zhuǎn)染隨機序列的對照組細胞中EphB4 mRNA表達水平無明顯變化。為探討EphB4/EphrinB2的關系，本實驗也同時檢測了EphB4表達變化對EphrinB2表達的影響，結(jié)果顯示，盡管SW480和Caco-2中EphB4表達均明顯下降，但是SW480細胞中EphrinB2的含量較干擾前明顯升高，而Caco-2細胞中EphrinB2的含量并未受到EphB4表達下降的影響，與干擾前相比無明顯改變。上述實驗進一步提示EphB4在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用并非絕對依賴于EphrinB2，兩者之間的相互作用可能受制于多種因子的調(diào)控，這種調(diào)控可能在腫瘤進展的不同階段又有所不同。

綜上所述，本研究通過構(gòu)建靶向EphB4的慢病毒載體成功干擾了結(jié)腸癌細胞系SW480及Caco-2中EphB4基因的表達，并證實 EphB4含量變化對EphrinB2表達水平的影響并不一致，EphB4在結(jié)腸癌中的作用機制及其與EphrinB2的相互作用尚需進一步實驗研究。

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