北蟲草液體菌種培養(yǎng)的研究

曹 婧，張九天

(吉林省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，長春 130103)

引言

北蟲草又名蛹蟲草（Cordyceps militaris (L.) Link），是一種名貴的食藥用滋補(bǔ)真菌，具有極高開發(fā)價(jià)值。北蟲草含有多種有效活性物質(zhì)，具有抗菌、抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等功能[1，2]。

目前，液體菌種在北蟲草的人工栽培中得到廣泛的應(yīng)用，菌種的質(zhì)量直接影響蟲草子實(shí)體的產(chǎn)量和質(zhì)量，但迄今為止液體菌種沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。菌種的菌絲量是衡量菌種質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)，但菌球直徑過大，會(huì)影響物質(zhì)、氧氣的傳輸，不能達(dá)到菌球的中心，菌球內(nèi)部缺乏營養(yǎng)，形成中空型菌球，影響正常代謝，最終會(huì)影響到人工栽培的經(jīng)濟(jì)效益。根據(jù)北蟲草栽培的實(shí)際，液體菌種的菌球大小、菌種的萌發(fā)力、菌絲的生物量指標(biāo)也是衡量液體菌種質(zhì)量的重要指標(biāo)。

該試驗(yàn)通過液體菌種的培養(yǎng)條件的優(yōu)化，篩選出最佳培養(yǎng)條件，為液體菌種應(yīng)用于生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

野生北蟲草YS2和YS3菌株采自沈陽棋盤山，人工培養(yǎng)北蟲草K37、B2、4號(hào)、2號(hào)、B、J、C和7號(hào)菌株來自于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物研究室。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨 3 g，KH2PO43 g， MgSO41 g，VB11 g，瓊脂 20 g，自來水 1 000mL，pH 7.0。

（2）液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨3 g， MgSO43 g， 自來水 1000mL， pH 7.0。

（3）栽培瓶培養(yǎng)基：小麥30g，自來水45mL。

1.2 方法

1.2.1 液體菌種的培養(yǎng)

將北蟲草母種接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，在22～24℃下恒溫培養(yǎng)。然后接種到固體平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件相同，5～6天后，用無菌打孔器打孔，將菌片接種到裝有100mL液體加富PDA培養(yǎng)基的滴流瓶中， 20～23℃下，搖床振蕩培養(yǎng)[3]。

1.2.2 菌絲量的測定

隨機(jī)選取5瓶液體菌種，取出接種菌塊，用8層紗布過濾，用蒸餾水沖洗，操作重復(fù)2～3次后，置于濾紙上，60℃恒溫通風(fēng)培養(yǎng)箱中烘干，稱重。

1.2.3 菌球直徑的測定

隨機(jī)選取100個(gè)菌球置于培養(yǎng)皿中，用濾紙條吸取多余的水分，且保證不因菌球變形而影響測量，測量各菌球的直徑，計(jì)算總和，求出平均值。

1.2.4 不同菌株菌球形態(tài)和菌絲量的比較

將10個(gè)北蟲草菌株在相同條件下進(jìn)行液體培養(yǎng)，當(dāng)菌球密度和菌絲量不再增長時(shí)，測定菌球直徑，收集菌絲烘干稱重，對(duì)不同菌株進(jìn)行比較。

1.2.5 營養(yǎng)成分對(duì)菌球形態(tài)和菌絲量的影響

（1）配制PDA液體培養(yǎng)基，其中分別以葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、麥芽糖和乳糖作為碳源，其他成分固定不變，每個(gè)處理重復(fù)5次[4]。

（2）配制PDA液體培養(yǎng)基，其中分別以蛋白胨、酵母粉、尿素、硝酸銨和氯化銨作為氮源，其他成分固定不變，每個(gè)處理重復(fù)5次。

（3）配制PDA液體培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中分別添加硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鋅和氯化鈉等微量元素，其他成分固定不變，未添加的培養(yǎng)基作為對(duì)照組，每個(gè)處理重復(fù)5次。

接種后放置到轉(zhuǎn)速為120 r/min的搖床上，23℃培養(yǎng)，每24小時(shí)觀察1次，當(dāng)菌球密度和菌絲量不再增長時(shí)，測定菌球直徑，收集菌絲烘干稱重。

1.2.6 培養(yǎng)條件對(duì)菌球形態(tài)和菌絲量的影響

將液體培養(yǎng)基pH值配制為5個(gè)梯度：5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，每個(gè)處理重復(fù)5次。接種后放置到轉(zhuǎn)速為120 r/min的搖床上，23℃培養(yǎng)，每24小時(shí)觀察1次，測定菌球直徑和菌絲干重[5]。

將液體菌種培養(yǎng)轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為80r/min、100r/min、120r/min、140r/min、160r/min，每個(gè)處理重復(fù)10次。23℃培養(yǎng)，每24小時(shí)觀察1次，測定菌球直徑和菌絲干重[6]。

1.2.7 不同大小菌球萌發(fā)力的對(duì)比

將含不同大小菌球的液體菌種分別接種到20個(gè)栽培瓶中，在22～24℃下培養(yǎng)，觀察萌發(fā)時(shí)間、長勢和產(chǎn)量[7]。

1.2.8 不同培養(yǎng)時(shí)間菌球萌發(fā)力的對(duì)比

當(dāng)液體菌種菌絲體密度很大，并且繼續(xù)增加不明顯時(shí)，作為處理A；另一組在搖床上繼續(xù)培養(yǎng)2～3天，作為處理B，將A、B兩組的液體菌種分別接種到20個(gè)栽培瓶中，在22～24℃下培養(yǎng)，觀察萌發(fā)時(shí)間、長勢和產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株菌球形態(tài)和菌絲量的比較

10個(gè)菌株在培養(yǎng)條件相同的情況下，雖然成球的時(shí)間有1～2天的差異，但菌球大小差異很小，100ml液體菌種的菌絲干重均在1.14 g左右。

2.2 營養(yǎng)成分對(duì)菌球形態(tài)和菌絲量的影響

2.2.1 碳源對(duì)菌球形態(tài)和菌絲量的影響

表1為菌球在菌球密度和菌絲量穩(wěn)定時(shí)5種碳源培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)。其中以可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基中菌球的直徑最大，在3～4mm之間，成球均勻；葡萄糖作碳源時(shí)，菌球直徑在1～2mm之間；蔗糖作為碳源時(shí)，菌球直徑最小，在0.5～1mm之間。

在菌絲干重的測定中，以葡萄糖作為碳源時(shí)，菌絲干重最大，其次為蔗糖、乳糖和麥芽糖，可溶性淀粉作為碳源時(shí)，菌絲的干重最小。

2.2.2 氮源對(duì)菌球形態(tài)和菌絲量的影響

表2為菌球在菌球密度和菌絲量穩(wěn)定時(shí)5種氮源培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)。可以看出5種氮源中，以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基中菌球的直徑最大，在2～3mm之間；其次為以尿素作為氮源的培養(yǎng)基，形成菌球的直徑在1～2mm之間；以硝酸銨、酵母粉、氯化銨作為氮源時(shí)，菌球直徑均較小，在0.5～1mm之間，菌球數(shù)量較少，密度較小。氯化銨作為氮源時(shí)，直徑小于0.5mm。

在菌絲干重的測定中，以蛋白胨作為氮源時(shí)，菌絲干重最大，其次為酵母粉。尿素、氯化銨、硝酸銨3種無機(jī)氮源形成菌絲的干重較小。

2.2.3 微量元素對(duì)菌球形態(tài)和菌絲量的影響

由表3可以看出，添加的4種營養(yǎng)物質(zhì)中，添加硫酸錳的培養(yǎng)基中菌球的直徑最大，其次為添加了硫酸鋅的培養(yǎng)基，這兩種培養(yǎng)基中菌絲直徑均在1～2mm之間；添加硫酸亞鐵和氯化鈉的培養(yǎng)基，形成菌球的直徑在0.5～1mm之間，其中添加硫酸亞鐵后，形成的菌球不均勻。

在菌絲干重的測定中，4種培養(yǎng)基中除添加氯化鈉的菌絲干重略低，其他幾種相差不明顯，但均比對(duì)照組菌絲干重低。

2.3 培養(yǎng)條件對(duì)菌球形態(tài)和菌絲量的影響

2.3.1 pH對(duì)菌球形態(tài)和菌絲量的影響

培養(yǎng)到第5天時(shí)，菌球生長狀態(tài)趨于穩(wěn)定，進(jìn)行測量。由表4可以看出，在初始pH值為5.0和9.0時(shí)不能形成菌球；當(dāng)pH值在6.0～8.0之間時(shí)，菌球直徑大小差異不明顯，均在1～2mm之間；pH值為7.0時(shí)，菌球直徑最大；pH值為8.0時(shí)，形成的菌球大小有些不均勻。對(duì)菌絲干重的測定中，pH值在6.0～8.0之間時(shí)，菌絲干重呈遞減的趨勢。

2.3.2 振蕩頻率對(duì)菌球形態(tài)和菌絲量的影響

由試驗(yàn)結(jié)果可以看出，搖床的振蕩頻率越大，菌球的直徑越小。菌絲的干重是隨著振蕩頻率的增大而增加，振蕩頻率為140 r/min和160 r/min時(shí)，菌絲干重相差不明顯。

2.4 不同大小菌球萌發(fā)力的對(duì)比

由表6可以看出，在栽培試驗(yàn)中，當(dāng)菌球直徑小于1 mm時(shí)，菌絲萌發(fā)時(shí)間長，并且菌絲生長緩慢，子實(shí)體產(chǎn)量也很低。菌球直徑在1～3mm區(qū)間時(shí)，菌絲萌發(fā)較快，長勢良好，產(chǎn)量高且穩(wěn)定。菌球直徑大于3mm時(shí)，菌球雖然萌發(fā)快，但菌絲稍厚一些，影響出草狀態(tài)，產(chǎn)量偏低。在生產(chǎn)中，菌球過大時(shí)會(huì)先經(jīng)過打碎處理，然后再進(jìn)行接種，這樣既浪費(fèi)人力和時(shí)間，也會(huì)增大接種過程中污染的概率。在不影響萌發(fā)力的前提下，菌球越小，接種越便利，所以菌球大小在1～2mm區(qū)間時(shí)最為理想。

表1 菌球在不同碳源培養(yǎng)基的生長狀態(tài)

表2 菌球在不同氮源培養(yǎng)基的生長狀態(tài)

表3 菌球在不同微量元素培養(yǎng)基的生長狀態(tài)

試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)到第5天時(shí)液體菌種菌絲體密度很大，并且繼續(xù)增加不明顯。A組和B組的菌球成球狀態(tài)均較好，但A組菌球呈懸浮狀態(tài)，B組菌球呈沉降狀態(tài)。在栽培試驗(yàn)中，A組和B組的長勢都良好，但B組的萌發(fā)時(shí)間和產(chǎn)量都比A組偏低一些。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)選取的10個(gè)菌株的液體菌種進(jìn)行比較，不同菌株液體菌種的菌絲量和菌球形態(tài)差異不大，所以本試驗(yàn)隨機(jī)選擇其中的一個(gè)菌株對(duì)液體菌種培養(yǎng)的營養(yǎng)條件和液體培養(yǎng)過程的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以得到適于人工栽培的液體菌種。對(duì)菌絲生長量、菌球直徑、萌發(fā)力這幾個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，結(jié)果表明，北蟲草液體菌種培養(yǎng)營養(yǎng)成分以葡萄糖作為碳源、尿素作為氮源，添加適量的硫酸鋅，培養(yǎng)條件為pH值6.0，振蕩頻率140 r/min，培養(yǎng)5天最為理想。北蟲草液體菌種培養(yǎng)的研究為生產(chǎn)中液體菌種的規(guī)范化提供了一定的參考依據(jù)，具有廣泛的應(yīng)用前景。

表4 菌球在不同pH條件培養(yǎng)基的生長狀態(tài)

表5 菌球在不同振蕩頻率下的生長狀態(tài)

表6 不同大小菌球的萌發(fā)力

表7 不同培養(yǎng)時(shí)間下菌球的萌發(fā)力

[1]柴建萍,白興榮,謝道燕,等.蛹蟲草多糖的分離純化及其結(jié)構(gòu)的初步研究.中國生化藥物雜志,2003,24(1):23～25

[2]韋會(huì)平,肖波,胡開治.蛹蟲草藥用價(jià)值考.中藥材,2004,27(3):215～216

[3]李維光,蘇鳳巖,黃革.北冬蟲夏草菌絲體噸級(jí)液體深層發(fā)酵及生理活性物質(zhì)的研究.微生物學(xué)雜志,1997,17(1):36～37

[4]陳晉安,黃浩,鄭忠輝,等.蛹蟲草液體發(fā)酵條件的研究.集美大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2001,6(3):219～223

[5]張長鎧,趙友春,吳志紅,白毓謙.冬蟲夏草菌絲生長的營養(yǎng)需求.微生物學(xué)通報(bào).1992,(3)

[6]汪宇,于榮敏,佟志清,等.蛹蟲草液體培養(yǎng)條件的優(yōu)化及生產(chǎn)動(dòng)力學(xué)考察.中國野生植物資源,2003,22(4):56～60

[7]姜明蘭,鐘文田.北冬蟲夏草人工栽培技術(shù)研究.遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué),1995,(5):54～57