刺梨中黃酮的超聲提取及HPLC測(cè)定

王振偉+申森+胡曉冰

摘要：采用超聲波輔助提取刺梨（Rose roxburghii Tratt.）中總黃酮，利用正交試驗(yàn)進(jìn)行工藝優(yōu)化，初步建立了刺梨中黃酮的HPLC測(cè)定方法。結(jié)果表明，超聲功率、提取時(shí)間和溫度均對(duì)刺梨中黃酮提取結(jié)果影響顯著，確定超聲輔助提取刺梨黃酮的最佳工藝條件為超聲功率300 W，50%乙醇，溫度40 ℃，提取時(shí)間為40 min。在此條件下，刺梨黃酮的得率為1.862%。與常規(guī)回流提取方法相比，黃酮得率有所增加，同時(shí)縮短了提取時(shí)間。HPLC法測(cè)定結(jié)果表明，刺梨中含有蘆丁和槲皮素。HPLC法簡(jiǎn)便、快捷、靈敏、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于刺梨中黃酮成分含量的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：刺梨（Rose roxburghii Tratt.）；超聲波；總黃酮；提?。桓咝б合嗌V

中圖分類號(hào)：S79 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）19-4684-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.19.046

Extracting Total Flavonoids from Rosa roxburghii Tratt. with Ultrasonic Wave

and Determination by HPLC

WANG Zhen-wei， SHEN Sen， HU Xiao-bing

（Yellow River Conservancy Technical Institute， Kaifeng 475000，Henan， China）

Abstract：The technology of extracting total flavonoids from Rosa roxburghii Tratt with ultrasonic wave was studied. The ultrasonic wave -assisted extraction technology was optimized by orthogonal test. HPLC method in Rosa roxburghii Tratt. was established. Results showed that the effects of ultrasonic power，extraction time and temperature on extraction rate of total flavonoids were significant. The optimum conditions were the ultrasonic power of 300 W，50% ethanol， temperature of 40 ℃ and extraction time of 40 min. Under these conditions， the yield of total flavonoids was 1.862%. Compared with reflux extraction，the yield of flavonoids increased and the extraction time was shorter. It is indicated that the method was simple，accurate and sensitive and could be used in determing content of rutin and quercetin.

Key words：Rosa roxburghii Tratt.； ultrasonic wave； total flavonoids； extraction； HPLC

刺梨（Rose roxburghii Tratt.）是薔薇科薔薇屬落葉灌木，又名繅絲花、文先果、送春歸，多分布于貴州、云南等地[1]，近些年已北移河南栽植成功。刺梨營(yíng)養(yǎng)豐富，維生素C、超氧化物歧化酶（SOD）含量高，此外還含有豐富的微量元素，具有提高免疫功能、延緩衰老、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤、解毒鎮(zhèn)靜、降血脂等多種作用[2-4]。

黃酮類化合物作為刺梨的主要生物活性成分之一，具有消除自由基、抗氧化、降血糖血脂、降血壓、抗腫瘤等作用。目前國內(nèi)外從植物中提取總黃酮的方法很多，包括酶法、微波萃取、超臨界萃取、堿性稀醇提取以及超聲提取法等[5-7]。其中，超聲輔助提取技術(shù)替代傳統(tǒng)提取技術(shù)，其應(yīng)用水平在不斷地提升，原理是利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)、空化作用、粉碎作用，將植物中的活性成分提取到溶劑中去。本試驗(yàn)探討超聲輔助提取刺梨中的總黃酮，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化確定提取刺梨黃酮的最佳工藝參數(shù)，并建立了HPLC法測(cè)定刺梨提取物中蘆丁和槲皮素的方法，可為促進(jìn)刺梨的精深加工和綜合利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

刺梨，購自河南開封醫(yī)藥大廈。

蘆丁、槲皮素（標(biāo)準(zhǔn)品），中國藥品生物制品檢定所；甲醇，色譜純；磷酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇等均為分析純。

TU-1810型紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；KQ520ODB型數(shù)控超聲波清洗器（江蘇昆山超聲儀器有限公司）；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；HC-3018R型冷凍離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；AB204-L型電子天平（梅特勒-托利多公司），Waters 1525型高效液相色譜儀（美國沃特世公司）。

1.2 方法

1.2.1 刺梨黃酮的提取 準(zhǔn)確稱取干燥、粉碎、過40目篩的刺梨粉末2.00 g，按要求加人一定量的乙醇，在不同溫度、不同超聲功率條件下提取一定時(shí)間，減壓抽濾去渣，得到刺梨總黃酮提取液，測(cè)定提取液中黃酮含量。

1.2.2 單因素試驗(yàn) 分別對(duì)提取時(shí)間、溫度、超聲功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行研究，初步確定各因素的影響程度及較佳提取水平。①提取時(shí)間。在溫度為60 ℃，超聲功率300 W，料液比1∶20（m∶V，下同），60%乙醇的條件下提取，考察不同提取時(shí)間（20、30、40、50、60、70 min）對(duì)刺梨總黃酮提取效果的影響；②溫度。超聲功率300 W，料液比1∶20，60%乙醇提取40 min，考察不同溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）對(duì)刺梨總黃酮提取效果的影響；③超聲功率。在溫度為60 ℃，料液比1∶20，60%乙醇提取40 min，考察不同超聲波功率（100、200、300、400、500 W）對(duì)刺梨總黃酮提取效果的影響；④乙醇體積分?jǐn)?shù)。在溫度為60 ℃，料液比1∶20，200 W超聲提取40 min，考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（30%、40%、50%、60%、70%、80%）對(duì)刺梨總黃酮提取效果的影響。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取干燥恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.025 2 g，30%的乙醇定溶于100 mL容量瓶中，搖勻備用。吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，各加入30%的乙醇使其體積為5 mL；然后加入5%的NaNO2溶液0.3 mL搖勻，放置6 min；加入10%的Al（NO3）3溶液0.3 mL搖勻，放置6 min；加1 mol/L的NaOH溶液4 mL，30%乙醇定容至刻度并搖勻，放置15 min。以空白為對(duì)照，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為A=0.381 3C+0.006 2，R2=0.999 1。

1.2.4 黃酮提取率 取樣品提取液1 mL按照“1.2.3”的方法測(cè)定其吸光度值，從回歸方程中查出相應(yīng)的黃酮濃度，計(jì)算刺梨總黃酮得率。

總黃酮得率=提取液總黃酮濃度×提取液體積/樣品干質(zhì)量×100%

1.2.5 正交試驗(yàn) 在前期單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取溫度、超聲功率、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)4個(gè)因素，采用L9（34）正交試驗(yàn)考察各因素對(duì)刺梨黃酮提取效果的影響，以確定超聲提取刺梨黃酮的最佳工藝，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

1.2.6 刺梨黃酮HPLC分析 利用高效液相色譜法測(cè)定刺梨提取液中蘆丁、槲皮素的含量，分別精確稱取0.025 0 g蘆丁和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品，加甲醇溶解并定溶于25 mL容量瓶中，制成蘆丁和槲皮素對(duì)照品混合儲(chǔ)備液，取1 mL儲(chǔ)備液加甲醇定容至10 mL容量瓶中得到混合對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)液，0.45 μm濾膜過濾備用。超聲提取的刺梨黃酮原液，減壓蒸發(fā)后真空干燥得到粗提物，稱取0.050 0 g用甲醇溶解定容至50 mL（1 mg/mL），0.45 μm微孔濾膜過濾備用[8]。

高效液相色譜條件為：色譜柱，Waters sunfire ODS色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動(dòng)相，甲醇-0.2%磷酸溶液（60∶40），柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。5次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取時(shí)間 如圖1所示，提取時(shí)間在40 min內(nèi)，刺梨黃酮的溶出隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，超過40 min后，呈下降趨勢(shì)，這可能是因?yàn)槌曇鸬臒崃考鄱鴮?dǎo)致黃酮結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而損失。超聲波在較短時(shí)間內(nèi)能夠充分提取刺梨中的黃酮，可節(jié)約生產(chǎn)成本和能源消耗。因此，選擇提取40 min為宜。

2.1.2 溫度 如圖2所示，隨著溫度的升高，刺梨中黃酮得率逐漸增大，當(dāng)溫度升高到50 ℃時(shí)，黃酮得率最高，溫度再升高后黃酮得率呈下降趨勢(shì)。原因可能是隨著溫度的升高增加了黃酮的溶解度，同時(shí)提取液黏度減小，加快了黃酮的析出。當(dāng)溫度過高時(shí)，可溶性蛋白質(zhì)析出變性，黏度加大而影響細(xì)胞破裂，阻礙黃酮物質(zhì)的析出。因此，選擇溫度50 ℃為宜。

2.1.3 超聲功率 由圖3可知，隨著超聲功率的增加，刺梨黃酮得率先增加，超聲功率達(dá)到300 W時(shí)，黃酮得率達(dá)到最大，隨后逐漸減小，可能是因?yàn)槌暪β试礁?，超聲?qiáng)度越大，會(huì)增加細(xì)胞的滲透性，從而使較多的提取劑滲透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，提取出黃酮成分，而功率過大時(shí)，黃酮物質(zhì)已大量析出，收到超聲波強(qiáng)度的作用而發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，得率降低。因此，選擇超聲功率300 W為宜。

2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù) 如圖4所示，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，刺梨黃酮的得率隨之升高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%時(shí)，黃酮得率達(dá)到最大。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)高于60%時(shí)，黃酮得率下降，可能是某些脂溶性物質(zhì)的溶出，干擾因素隨之增加。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)60%為宜。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2結(jié)果可知，各種因素對(duì)刺梨中黃酮提取效果的影響主次順序?yàn)锳、C、D、B，即超聲功率、溫度、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)。刺梨黃酮超聲輔助提取最佳工藝為超聲功率300 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，溫度40 ℃，提取時(shí)間為40 min。根據(jù)表3方差分析結(jié)果可知，超聲功率、溫度和提取時(shí)間3種因素對(duì)刺梨黃酮提取的影響顯著，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)其影響較小。

2.3 超聲提取與常規(guī)回流提取效果比較

進(jìn)一步對(duì)超聲輔助提取與常規(guī)回流提取方法進(jìn)行比較，超聲輔助提取采用正交試驗(yàn)確定的最佳方案，常規(guī)回流采用50%的乙醇按照料液比1∶20在90 ℃回流5 h，每種方法重復(fù)5次，試驗(yàn)結(jié)果表明，超聲提取和常規(guī)回流提取的黃酮平均得率分別為1.862%、1.034%，超聲輔助提取可以大大縮短生產(chǎn)周期，提高產(chǎn)品得率。

2.4 黃酮提取液中蘆丁和槲皮素HPLC檢測(cè)

由圖5可知，通過保留時(shí)間進(jìn)行定性，蘆丁標(biāo)樣的保留時(shí)間為2.406 min，槲皮素樣品的保留時(shí)間是4.449 min，分別在2.315 min和4.633 min中出現(xiàn)譜峰，初步推斷在刺梨果中含有蘆丁和槲皮素成分。最后向樣品中加入蘆丁和槲皮素標(biāo)樣，譜峰1和2的峰高明顯增高，從而確定峰1就是蘆丁，峰2就是槲皮素。由此判斷，刺梨樣品中含有蘆丁和槲皮素成分。

利用HPLC法測(cè)定蘆丁和槲皮素的含量，蘆丁濃度與其峰高的線性回歸方程為Y=15 618X-11 087，R2=0.999 1，在2～100 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，根據(jù)外標(biāo)法和實(shí)際樣品的峰面積對(duì)蘆丁進(jìn)行定量測(cè)定，得到刺梨果中含0.702%的蘆丁成分（RSD=2.63%）。槲皮素線性回歸方程為Y=2 063.7X-923.8（R2=0.999 2）。槲皮素分別在1～100 μg/mL之間峰面積與進(jìn)樣濃度有良好的線性關(guān)系，得到刺梨果中含0.12%的槲皮素成分（RSD=1.57%）。

4 結(jié)論

1）正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表明，提取刺梨中黃酮的最佳方案為超聲功率300 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，溫度40 ℃，提取時(shí)間為40 min。各種因素對(duì)刺梨中黃酮提取效果的影響主次順序?yàn)槌暪β?、溫度、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)。方差分析結(jié)果表明，超聲功率、溫度和提取時(shí)間3種因素對(duì)黃酮的提取影響顯著，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)其影響較小。

2）超聲輔助提取與常規(guī)回流提取方法相比，黃酮得率更高。超聲輔助提取技術(shù)不僅可以解決傳統(tǒng)提取技術(shù)發(fā)展瓶頸，而且可以大大縮短生產(chǎn)周期，提高產(chǎn)品得率。

3）采用HPLC法測(cè)定刺梨黃酮提取物，結(jié)果表明其含有蘆丁和槲皮素。關(guān)于刺梨中黃酮成分的定性和定量分析還需要進(jìn)一步研究，并確定刺梨中黃酮的種類和含量。

參考文獻(xiàn)：

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[8] 田宏哲，周艷明，趙瑛博，等.刺梨中蘆丁成分的定量測(cè)定[J].食品科學(xué)，2009，30（10）：203-205.

利用HPLC法測(cè)定蘆丁和槲皮素的含量，蘆丁濃度與其峰高的線性回歸方程為Y=15 618X-11 087，R2=0.999 1，在2～100 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，根據(jù)外標(biāo)法和實(shí)際樣品的峰面積對(duì)蘆丁進(jìn)行定量測(cè)定，得到刺梨果中含0.702%的蘆丁成分（RSD=2.63%）。槲皮素線性回歸方程為Y=2 063.7X-923.8（R2=0.999 2）。槲皮素分別在1～100 μg/mL之間峰面積與進(jìn)樣濃度有良好的線性關(guān)系，得到刺梨果中含0.12%的槲皮素成分（RSD=1.57%）。

4 結(jié)論

1）正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表明，提取刺梨中黃酮的最佳方案為超聲功率300 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，溫度40 ℃，提取時(shí)間為40 min。各種因素對(duì)刺梨中黃酮提取效果的影響主次順序?yàn)槌暪β?、溫度、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)。方差分析結(jié)果表明，超聲功率、溫度和提取時(shí)間3種因素對(duì)黃酮的提取影響顯著，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)其影響較小。

2）超聲輔助提取與常規(guī)回流提取方法相比，黃酮得率更高。超聲輔助提取技術(shù)不僅可以解決傳統(tǒng)提取技術(shù)發(fā)展瓶頸，而且可以大大縮短生產(chǎn)周期，提高產(chǎn)品得率。

3）采用HPLC法測(cè)定刺梨黃酮提取物，結(jié)果表明其含有蘆丁和槲皮素。關(guān)于刺梨中黃酮成分的定性和定量分析還需要進(jìn)一步研究，并確定刺梨中黃酮的種類和含量。

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利用HPLC法測(cè)定蘆丁和槲皮素的含量，蘆丁濃度與其峰高的線性回歸方程為Y=15 618X-11 087，R2=0.999 1，在2～100 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，根據(jù)外標(biāo)法和實(shí)際樣品的峰面積對(duì)蘆丁進(jìn)行定量測(cè)定，得到刺梨果中含0.702%的蘆丁成分（RSD=2.63%）。槲皮素線性回歸方程為Y=2 063.7X-923.8（R2=0.999 2）。槲皮素分別在1～100 μg/mL之間峰面積與進(jìn)樣濃度有良好的線性關(guān)系，得到刺梨果中含0.12%的槲皮素成分（RSD=1.57%）。

4 結(jié)論

1）正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表明，提取刺梨中黃酮的最佳方案為超聲功率300 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，溫度40 ℃，提取時(shí)間為40 min。各種因素對(duì)刺梨中黃酮提取效果的影響主次順序?yàn)槌暪β?、溫度、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)。方差分析結(jié)果表明，超聲功率、溫度和提取時(shí)間3種因素對(duì)黃酮的提取影響顯著，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)其影響較小。

2）超聲輔助提取與常規(guī)回流提取方法相比，黃酮得率更高。超聲輔助提取技術(shù)不僅可以解決傳統(tǒng)提取技術(shù)發(fā)展瓶頸，而且可以大大縮短生產(chǎn)周期，提高產(chǎn)品得率。

3）采用HPLC法測(cè)定刺梨黃酮提取物，結(jié)果表明其含有蘆丁和槲皮素。關(guān)于刺梨中黃酮成分的定性和定量分析還需要進(jìn)一步研究，并確定刺梨中黃酮的種類和含量。

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