獨(dú)活總香豆素類成分的純化工藝研究

王曉林+徐茂林+鐘方麗+薛健飛+李晶

摘要：利用大孔吸附樹脂對獨(dú)活（Heracleum hemsleyanum Diels）中的總香豆素類成分進(jìn)行純化。采用靜態(tài)與動態(tài)吸附-解吸相結(jié)合的方法，以解吸量及解吸率為主要指標(biāo)對工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳純化工藝條件。結(jié)果表明，采用LX-36型大孔吸附樹脂純化效果較好，其最佳工藝條件為上柱藥液濃度相當(dāng)于原藥0.1 g/mL，上柱藥液pH為2.5～5.5，吸附速率為5 BV/h，上樣量相當(dāng)于樹脂量的50%，解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%，解吸速率為1 BV/h，解吸液用量為5 BV，經(jīng)LX-36型大孔吸附樹脂分離純化后的獨(dú)活干浸膏中總香豆素的含量由原來的8.42%升高到27.09%。表明LX-36型大孔吸附樹脂適于獨(dú)活總香豆素的初步純化。

關(guān)鍵詞： 獨(dú)活（Heracleum hemsleyanum Diels）；總香豆素；純化；大孔吸附樹脂

中圖分類號：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）19-4679-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.19.045

Technology of Purifying Total Coumarins in Heracleum hemsleyanum Diels

WANG Xiao-lin，XU Mao-lin，ZHONG Fang-li，XUE Jian-fei，LI Jing

（School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering， Jilin Institute of Chemical Technology， Jilin 132022，Jilin，China）

Abstract： The technology of purifying total coumarins（TC） in Heracleum hemsleyanum Diels with macroporous adsorption resin was optimized. Using static and dynamic state combined with desorption amount and desorption ratio method， the optimum purification conditions with macroporous adsorption resin were determined using adsorption and desorption rate of TC as evaluating indicators. The results showed that LX-36 macroporous adsorption resin had better purification effect than others. The TC content of the sample（equal to raw material）， pH value of sample， adsorption rate， amount of sample， ethanol content， desorption rate， the volume of eluant were 0.1 g/mL， 2.5 to 5.5， 5 BV/h， 50%（equal to the resin），95%， 1 BV/h， and 5 BV， respectively. Under these conditions， the purity of TC varied from 8.42% to 27.09%. It is indicated that LX-36 macroporous adsorption resin was suitable for initial purification of TC in Heracleum hemsleyanum Diels.

Key words： Heracleum hemsleyanum Diels；total coumarins； purification； macroporous adsorption resin

獨(dú)活（Heracleum hemsleyanum Diels）是傘形科植物重齒毛當(dāng)歸的干燥根，多生于陰濕山坡、林下草叢中或稀疏灌叢間，為常用中藥材[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，獨(dú)活具有鎮(zhèn)靜、催眠、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化、延緩腦老化、抗血小板凝集、抗腫瘤等多種活性[2-4]，獨(dú)活主要含有香豆素、揮發(fā)油、皂苷和黃酮等化學(xué)成分[5，6]，其中香豆素類化合物是其主要化學(xué)成分之一。香豆素類化合物是植物次生代謝產(chǎn)物，該類化合物在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用，如可以作為植物保護(hù)素，調(diào)節(jié)植物生長；抑制病原微生物、殺蟲、抑菌等[7]。香豆素類化合物還具有抗艾滋病、抗腫瘤、抗菌、降壓、抗輻射等多方面的生物活性[8]。大孔吸附樹脂是近年來發(fā)展起來的一類具有強(qiáng)吸附能力的高分子聚合物，具有吸附容量大、吸附迅速、解吸容易、再生效果好、使用周期長等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛地應(yīng)用于天然產(chǎn)物有效成分的提取、分離與純化[9，10]。

本試驗(yàn)對獨(dú)活總香豆素的吸附和解吸性能、大孔吸附樹脂柱純化獨(dú)活總香豆素工藝條件進(jìn)行研究，以期為開發(fā)、利用獨(dú)活資源提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

獨(dú)活購自安徽省亳州市華申藥業(yè)有限公司。

1.2 試劑和儀器

蛇床子素，中國藥品生物制品檢定所；大孔吸附樹脂（LSA-21型、LSA-10型、AB-8型、LX-36型、D-101型、LSA-33型），西安藍(lán)曉科技有限公司；硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、無水乙醇均為分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA型），上海亞榮生化儀器廠；紫外可見分光光度計(jì)（752N型）、電子天平（JY2002型），上海精密科學(xué)儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（CS101-AB型），中國重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；循環(huán)水真空泵（SHZ-D型），河南省鞏義市英峪儀器一廠。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取干燥至恒重的蛇床子素對照品10.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加入無水甲醇適量，超聲處理使其溶解，無水甲醇定容至刻度，制成濃度為0.2 mg/mL的蛇床子素對照品溶液。精確吸取上述蛇床子素對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL分別置于10 mL容量瓶中，加無水甲醇至刻度，以無水甲醇為空白，采用紫外分光光度法于波長322 nm處測定其吸光度[11]。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到的線性方程為A=0.078 73C+0.090 4，R=0.999 4，表明蛇床子素濃度在2.0～12.0 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

1.3.2 大孔吸附樹脂的預(yù)處理 稱取大孔吸附樹脂LX-36、LSA-33、LSA-10、D-101、AB-8和LSA-21各50 g，加入玻璃樹脂柱內(nèi)，先以95%乙醇連續(xù)洗滌數(shù)次約2 h，直至流出液加去離子水（1∶5，V∶V）不混濁為止，然后采用去離子水洗滌至無醇味，再用5%HCl溶液浸泡4 h后以4～6 BV/h的流速洗滌2 h，再用去離子水洗至中性，最后用2%NaOH溶液浸泡6 h后以4～6 BV/h洗滌2 h，再用去離子水洗至中性，抽濾至干，置于密閉容器中備用[12]。

1.3.3 獨(dú)活總香豆素上柱液的制備 取獨(dú)活粗粉25 g，加15倍量80%乙醇加熱回流提取3次，每次1.5 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮至無醇味，蒸餾水定容至250 mL，搖勻，備用。

1.3.4 樹脂類型的選擇

1）靜態(tài)吸附及解吸。稱取處理后的濕樹脂LX-36、LSA-33、LSA-10、D-101、AB-8、LSA-21各2 g，加入到100 mL具塞三角瓶中，加入40 mL總香豆素濃度為2.142 mg/mL的獨(dú)活提取液，每10 min振搖1次約30 s，共2 h，靜止48 h過濾，吸取各樹脂吸附后的溶液0.5 mL用于測定。將靜態(tài)吸附的樹脂抽濾至干，加入100 mL 95%乙醇解吸，每10 min振搖1次約30 s，持續(xù)2 h，靜置48 h過濾[13]，吸取各解吸液0.5 mL用于測定。按照“1.3.1”的方法于波長322 nm處測定吸光度A，計(jì)算各樹脂對獨(dú)活總香豆素的吸附率和解吸率。各指標(biāo)的計(jì)算公式如下[14]：

吸附率=[（C0×V0-C1×V1）/C0×V0]×100%

吸附量=C0×V0-C1×V1

解吸率={（V2× C2）/[C0×V0-C1×V1]}×100%

解吸量=V2 × C2

純度=（m2/m1）×100%

式中，C0為起始提取液中總香豆素濃度（mg/mL）；C1為吸附48 h后溶液中總香豆素濃度（mg/mL）；C2為解吸液中總香豆素濃度（mg/mL）；V1為提取液體積（mL）；V2為解吸液體積（mL）；m1為解吸液干燥后固體的稱樣量（mg）；m2為解吸液中總香豆素的測定量（mg）。

2）動態(tài)吸附及解吸。稱取處理后樹脂LX-36、AB-8、LSA-21各4 g，濕法上柱，分別加入40 mL總香豆素濃度為2.138 mg/mL的獨(dú)活提取液，以2 BV/h的流速進(jìn)行動態(tài)吸附，收集吸附后的溶液，吸取各吸附后的溶液適量，按照“1.3.1”的方法于波長322 nm處測定吸光度，再用50 mL 95%乙醇以2 BV/h的流速進(jìn)行動態(tài)解吸，分別收集各解吸液，吸取各解吸液適量，按照“1.3.1”的方法于波長322 nm處測定吸光度，分別計(jì)算獨(dú)活總香豆素的動態(tài)吸附率和解吸率。

1.3.5 吸附樹脂工藝的優(yōu)化

1）上樣量。取已處理的LX-36型大孔吸附樹脂6 g，濕法上柱，加入獨(dú)活提取液（總香豆素濃度為2.186 mg/mL），以2 BV/h的流速進(jìn)行吸附，每10 mL收集一份吸附后溶液，共5份，然后每5 mL收集一份吸附后溶液，共7份，按照“1.3.1”的方法于322 nm處測定每份吸附后溶液的吸光度，計(jì)算濃度，以吸附后溶液濃度為縱坐標(biāo)，吸附后溶液體積為橫坐標(biāo)繪制泄漏曲線[15]。

2）提取液上樣濃度。取已處理的LX-36型大孔吸附樹脂5份，每份各6 g，濕法上柱，分別加入獨(dú)活提取液（總香豆素濃度為4.301 mg/mL）以及稀釋了1～4倍的獨(dú)活提取液各15、30、45、60、75 mL，以2 BV/h的流速進(jìn)行吸附后，分別收集吸附后溶液并記錄體積用于測定。

3）上柱吸附速率。取已處理的LX-36型大孔吸附樹脂5份，每份各6 g，濕法上柱，分別加入獨(dú)活提取液各30 mL（總香豆素濃度為2.151 mg/mL），分別以1、2、3、4、5 BV/h的流速進(jìn)行吸附，收集吸附后溶液并記錄體積用于測定。

4）提取液pH。取已處理的LX-36型大孔吸附樹脂8份，每份各6 g，濕法上柱，準(zhǔn)備獨(dú)活提取液8份，每份30 mL（總香豆素濃度為2.179 mg/mL），分別調(diào)pH為1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5，加入柱內(nèi)，以5 BV/h的流速進(jìn)行吸附，收集吸附后溶液并記錄體積用于測定。

吸取2）、3）、4）中吸附后的溶液適量，按照“1.3.1”的方法于波長322 nm處測定吸光度，然后用50 mL 95%乙醇以2 BV/h的流速進(jìn)行解吸，收集解吸液并記錄體積，吸取各解吸液適量，按照“1.3.1”的方法測定吸光度，計(jì)算吸附率、解吸率。

5） 解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)。取已處理的LX-36型大孔吸附樹脂5份，每份各6 g，濕法上柱，分別加獨(dú)活提取液各30 mL（總香豆素濃度為2.165 mg/mL），以5 BV/h的流速進(jìn)行吸附，收集吸附后溶液并記錄體積，吸取各吸附后的溶液適量，按照“1.3.1”的方法測定吸光度，然后分別加10%、30%、50%、75%、95%乙醇各50 mL以2 BV/h的流速進(jìn)行解吸，分別收集解吸液并記錄體積，測定吸光度，計(jì)算吸附率、解吸率。

6）解吸速率。取已處理的LX-36型大孔吸附樹脂5份，每份各6 g，濕法上柱，分別加入獨(dú)活提取液各30 mL（總香豆素濃度為2.168 mg/mL），以5 BV/h的流速進(jìn)行吸附，收集吸附后溶液并記錄體積，然后加95%乙醇50 mL，分別以1、2、3、4、5 BV/h的流速進(jìn)行解吸，收集解吸液并記錄體積，測定吸光度，計(jì)算吸附率、解吸率。

7）解吸液用量。取已處理的LX-36型大孔吸附樹脂6 g，濕法上柱，加入獨(dú)活提取液30 mL（總香豆素濃度為2.180 mg/mL），以5 BV/h的流速進(jìn)行吸附，收集吸附后溶液并記錄體積，經(jīng)計(jì)算其吸附量為61.53 mg，吸附率為94.08%，然后采用95%乙醇以1 BV/h的流速進(jìn)行解吸，第1～5個流份為10 mL，第6～14個流份為5 mL收集解吸液，測定其吸光度，計(jì)算解吸液中總香豆素的濃度和解吸量。

1.3.6 工藝穩(wěn)定性驗(yàn)證 為了考察上述工藝條件的穩(wěn)定性，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，取已處理的LX-36型大孔吸附樹脂3份，各12 g，濕法上柱，分別加入獨(dú)活提取液各60 mL（總香豆素濃度為2.182 mg/mL），以5 BV/h的流速進(jìn)行吸附，收集吸附后溶液并記錄體積，然后加95%乙醇90 mL，以1 BV/h的流速進(jìn)行解吸，分別收集解吸液并記錄體積，測定其吸光度，計(jì)算吸附率、解吸率。再各取80 mL解吸液、40 mL獨(dú)活提取液原液倒入稱重后的蒸發(fā)皿中水浴蒸干，然后放入80 ℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒重，計(jì)算浸膏中總香豆素的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹脂類型的選擇

2.1.1 靜態(tài)吸附及解吸 從表1可以看出，綜合6 種大孔樹脂對獨(dú)活總香豆素的吸附量、吸附率、解吸量和解吸率可知，LX-36、AB-8、LSA-21 3種樹脂對獨(dú)活總香豆素的純化效果相對較好，所以選擇LX-36、AB-8、LSA-21樹脂進(jìn)行動態(tài)研究，以便選擇適合純化獨(dú)活總香豆素的最佳樹脂。

2.1.2 動態(tài)吸附及解吸 由表2可知，上述3種樹脂對獨(dú)活總香豆素的解吸率均高于90%，但LX-36型樹脂的吸附量和解吸量均高于另外2種樹脂，故選擇LX-36型樹脂進(jìn)行工藝優(yōu)化的研究。

2.2 LX-36型大孔吸附樹脂工藝優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 上樣量 從圖1中可以看出，當(dāng)吸附后溶液體積為30 mL時，吸附后溶液濃度明顯升高，有大量泄漏。此時，上樣量折合原藥材3 g，因此藥材∶樹脂以1∶2（m∶m，g∶g）較為合適，即上樣量（原藥材）相當(dāng)于樹脂量的50%。

2.2.2 提取液上樣濃度 由表3可知，除提取液上樣濃度為4.301 0 mg/mL時對獨(dú)活總香豆素的吸附率較低外，其他4種上樣濃度的吸附率均高于90.00%，解吸量除上樣濃度為4.301 0 mg/mL時較低外，其他4種上樣濃度的解吸量均高于53.00 mg，綜合吸附量、吸附率、解吸量和解吸率可知，選擇提取液上樣濃度為2.150 5 mg/mL（相當(dāng)于原生藥濃度0.1 g/mL）為上柱藥液濃度。

2.2.3 上柱吸附速率 由表4可知，上柱吸附速率對獨(dú)活總香豆素的吸附率和解吸率影響均較小，不同吸附速率下對獨(dú)活總香豆素的吸附率和解吸率差異不大。從節(jié)約時間的角度出發(fā)，吸附速率選擇以5 BV/h為宜。

2.2.4 提取液pH 由表5可知，提取液pH不同，對樹脂的純化效果有較大的影響，pH為2.5～5.5時對獨(dú)活總香豆素的吸附率和解吸率均比較理想。所以選擇提取液pH為4.5左右進(jìn)行上樣。

2.2.5 解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù) 解吸液乙醇的體積分?jǐn)?shù)不同，其極性也不同，對獨(dú)活總香豆素的解吸能力也就不同。由表6可知，在其他純化工藝條件固定時，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，對獨(dú)活總香豆素的解吸率逐漸增大，當(dāng)乙醇濃度為95%時，其解吸率高達(dá)90.98%，所以將解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)固定為95%。

2.2.6 解吸速率 由表7可知，解吸速率對獨(dú)活總香豆素的解吸率有一定的影響，解吸速率越慢，對獨(dú)活總香豆素的解吸效果越好。當(dāng)解吸速率為1 BV/h時，解吸率達(dá)到93.47%，所以確定最佳解吸速率為1 BV/h。

2.2.7 解吸液用量 由圖2可知，當(dāng)解吸液用量為95 mL時，解吸液中總香豆素的解吸量為58.25 mg，其解吸率為94.67%，當(dāng)解吸液用量為40 mL時，總香豆素的解吸量為55.45 mg，占總解吸量的95.19%，當(dāng)解吸液用量為50 mL時，總香豆素的解吸量為57.14 mg，占總解吸量的98.09%，從節(jié)約乙醇用量的角度出發(fā)，解吸液用量選擇45 mL左右時即可將獨(dú)活總香豆素解吸完全。

2.3 LX-36型大孔吸附樹脂純化獨(dú)活總香豆素工藝穩(wěn)定性驗(yàn)證

由以上結(jié)果可知，采用LX-36型大孔吸附樹脂純化獨(dú)活總香豆素的較佳工藝為：提取液上樣量為藥材∶樹脂1∶2，提取液上樣濃度相當(dāng)于原藥液濃度0.1 g/mL，提取液pH為4.5，上樣吸附速率為5 BV/h，解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)95%，解吸速率為1 BV/h，解吸液用量為45 mL左右。通過3次工藝穩(wěn)定性驗(yàn)證試驗(yàn)，得到干浸膏中總香豆素含量分別為27.07%、26.97%、27.23%，平均為27.09%?？梢钥闯?，經(jīng)LX-36型大孔吸附樹脂處理獨(dú)活提取液后，干膏中總香豆素含量可由8.42%提高到27.09%（表8）。

3 結(jié)論

采用6種不同型號的大孔吸附樹脂對獨(dú)活總香豆素的純化工藝進(jìn)行了試驗(yàn)，通過對影響大孔吸附樹脂吸附及解吸的各種因素的研究，確定了LX-36型大孔吸附樹脂分離純化獨(dú)活總香豆素的效果相對比較理想，其純化工藝條件為獨(dú)活提取液上樣量為藥材∶樹脂1∶2，提取液上柱濃度相當(dāng)于原藥濃度0.1 g/mL，提取液pH為4.5，上樣吸附速率為5 BV/h，再用5倍柱體積的95%乙醇以1 BV/h的流速進(jìn)行解吸，解吸率可以高達(dá)92.73%，純化后的干浸膏中總香豆素的含量由原來的8.42%升高到27.09%，表明LX-36型大孔樹脂對獨(dú)活總香豆素具有一定的純化性能，為獨(dú)活的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了基本依據(jù)。

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3 結(jié)論

采用6種不同型號的大孔吸附樹脂對獨(dú)活總香豆素的純化工藝進(jìn)行了試驗(yàn)，通過對影響大孔吸附樹脂吸附及解吸的各種因素的研究，確定了LX-36型大孔吸附樹脂分離純化獨(dú)活總香豆素的效果相對比較理想，其純化工藝條件為獨(dú)活提取液上樣量為藥材∶樹脂1∶2，提取液上柱濃度相當(dāng)于原藥濃度0.1 g/mL，提取液pH為4.5，上樣吸附速率為5 BV/h，再用5倍柱體積的95%乙醇以1 BV/h的流速進(jìn)行解吸，解吸率可以高達(dá)92.73%，純化后的干浸膏中總香豆素的含量由原來的8.42%升高到27.09%，表明LX-36型大孔樹脂對獨(dú)活總香豆素具有一定的純化性能，為獨(dú)活的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了基本依據(jù)。

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3 結(jié)論

采用6種不同型號的大孔吸附樹脂對獨(dú)活總香豆素的純化工藝進(jìn)行了試驗(yàn)，通過對影響大孔吸附樹脂吸附及解吸的各種因素的研究，確定了LX-36型大孔吸附樹脂分離純化獨(dú)活總香豆素的效果相對比較理想，其純化工藝條件為獨(dú)活提取液上樣量為藥材∶樹脂1∶2，提取液上柱濃度相當(dāng)于原藥濃度0.1 g/mL，提取液pH為4.5，上樣吸附速率為5 BV/h，再用5倍柱體積的95%乙醇以1 BV/h的流速進(jìn)行解吸，解吸率可以高達(dá)92.73%，純化后的干浸膏中總香豆素的含量由原來的8.42%升高到27.09%，表明LX-36型大孔樹脂對獨(dú)活總香豆素具有一定的純化性能，為獨(dú)活的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了基本依據(jù)。

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