Sr18菌代謝產(chǎn)物對(duì)松材線蟲(chóng)蛋白質(zhì)和酶活力的影響

侯金麗+馮欣

摘要：基于Sr18菌（Syncephalastrum racemosum）代謝產(chǎn)物在8 h內(nèi)具有顯著的殺線蟲(chóng)活性，測(cè)定了其在8 h內(nèi)對(duì)松樹(shù)線蟲(chóng)體內(nèi)總蛋白質(zhì)含量、SOD、CAT、TChE和ATP酶活性的影響。結(jié)果表明，4 h時(shí)處理組總蛋白質(zhì)的含量陡增至0.544 2 mg/mL，顯著高于對(duì)照組0.429 1 mg/mL，Sr18菌代謝產(chǎn)物干擾了線蟲(chóng)體內(nèi)蛋白質(zhì)的代謝；在8 h內(nèi)，處理組的SOD、CAT、TChE和ATP酶這4種酶活性均低于對(duì)照組，Sr18菌代謝產(chǎn)物對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)這4種酶都有不同程度的影響。這一結(jié)果為利用Sr18菌代謝產(chǎn)物研究和開(kāi)發(fā)微生物源殺線劑奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：Sr18菌（Syncephalastrum racemosum）代謝產(chǎn)物；線蟲(chóng)；蛋白質(zhì)含量；酶活

中圖分類號(hào)：S433.89 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）19-4604-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.19.025

Effects of Sr18 Fungi Metabolites on the Protein Content and the Enzyme

Activities in the Nematode

HOU Jin-li1，F(xiàn)ENG Xin2

（1.Henan Industry and Trade Vocational College， Department of Food Engineering ， Zhengzhou 451191， China；

2.Tianjin Key Laboratory of Animals and Plants Resistance， Tianjin Normal University， College of life science， Tianjin 300387， China）

Abstract： Based on Sr18 fungi metabolites with significant nematicidal activity in 8 h， the effects of this extract were evaluated on the content of total protein， the enzyme activities of SOD， CAT， TChE and ATP in 8 h. The results showed that in 4h， the content of total protein in the treatment group increased sharply to 0.544 2 mg/ml， significantly higher than that of the control group（0.429 1 mg/ml）， indicating that Sr18 fungi metabolites were interfered with the nematode protein metabolism. In 8 h， the enzyme activities of SOD， CAT， TChE and ATP of the treatment group were lower than that of the control group， indicating that Sr18 fungi metabolites had different effects on these four kinds of enzyme in the nematode. It will provide a theoretical basis for developing nematicides with microbial resources.

Key words： Sr18（Syncephalastrum racemosum） fungi metabolites； nematode； protein content； enzyme activities.

植物寄生線蟲(chóng)是一類世界性分布的重要植物病原體，其寄生范圍廣，不僅對(duì)林木的危害十分嚴(yán)重，對(duì)全世界農(nóng)作物的生產(chǎn)也構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界植物寄生線蟲(chóng)不僅造成年經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)1 000億美元，還給人類和動(dòng)物帶來(lái)嚴(yán)重的疾病[1-4]。目前應(yīng)用最廣泛的化學(xué)藥劑產(chǎn)生了環(huán)境污染和增強(qiáng)了線蟲(chóng)抗藥性等諸多問(wèn)題，化學(xué)殺線劑的應(yīng)用受到一定的限制。隨著人類環(huán)保意識(shí)的提高，生物防治成為線蟲(chóng)防治的主導(dǎo)[5]。絲狀真菌Sr18（Syncephalastrum racemosum）是本課題組從土壤中篩選出的一株生防菌，其代謝產(chǎn)物在8 h內(nèi)具有極強(qiáng)的殺線蟲(chóng)活性[6]。為進(jìn)一步明確Sr18對(duì)線蟲(chóng)的毒殺機(jī)理，本研究在此基礎(chǔ)上，選定松材線蟲(chóng)（以下簡(jiǎn)稱“線蟲(chóng)”）為試驗(yàn)對(duì)象，研究了Sr18菌代謝產(chǎn)物在8 h內(nèi)對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)總蛋白質(zhì)含量、保護(hù)酶（SOD、CAT）活性、神經(jīng)系統(tǒng)關(guān)鍵酶（TChE）活性和能量產(chǎn)生關(guān)鍵酶（ATP酶）活性的影響，為利用該菌研究和開(kāi)發(fā)微生物源殺線劑奠定理論基礎(chǔ)，同時(shí)為生物防控線蟲(chóng)提供了新的途徑和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

Sr18菌種由天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。27 ℃，在PS液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)4 d后，過(guò)濾去掉菌體，收集培養(yǎng)液。線蟲(chóng)由中國(guó)林科院森環(huán)森保所提供。線蟲(chóng)用以察氏培養(yǎng)基培養(yǎng)的灰葡萄孢菌 （Batrytis cinerea， BC菌） 避光（26±1） ℃飼養(yǎng)5～7 d。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 線蟲(chóng)處理方法 采用浸漬處理法。在（26±1）℃的環(huán)境下，67 mL Sr18菌代謝產(chǎn)物中加入約100 000條線蟲(chóng)，然后分別處理0、2、4、6、8 h。在相應(yīng)PS液體培養(yǎng)基中加入等量的線蟲(chóng)作為對(duì)照。

1.2.2 生理生化指標(biāo)的測(cè)定 分別于試驗(yàn)設(shè)定的時(shí)間內(nèi)將浸漬處理后的線蟲(chóng)離心收集，置于預(yù)冷的滅菌勻漿器中，加入4 mL預(yù)冷勻漿緩沖液，反復(fù)凍融3次[7]，然后冰上勻漿15 min，漿液進(jìn)行超聲破碎（破碎條件為超聲破碎10 s，間隔30 s，共30次，功率400 W[8]）。破碎產(chǎn)物以3 000 r/min，4 ℃離心20 min，收取離心后的上清液即為總蛋白質(zhì)樣品。

蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮蘭G250染色法；過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[9]；乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AchE）、超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD）、超微量ATP酶活性測(cè)定采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sr18菌代謝產(chǎn)物對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)蛋白質(zhì)含量的影響

Sr18菌代謝產(chǎn)物在不同時(shí)間對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)蛋白質(zhì)含量的影響見(jiàn)圖1。由圖1可知，在處理2 h左右，Sr18菌代謝產(chǎn)物處理的線蟲(chóng)體內(nèi)總蛋白質(zhì)含量和對(duì)照相比沒(méi)有明顯差異，當(dāng)處理時(shí)間延長(zhǎng)到3～4 h，可以檢測(cè)到Sr18菌代謝產(chǎn)物處理的線蟲(chóng)體內(nèi)總蛋白質(zhì)含量急劇升高至0.544 2 mg/mL，而且明顯高于正常培養(yǎng)情況下的線蟲(chóng)體內(nèi)總蛋白質(zhì)含量0.429 1 mg/mL。在4～6 h，Sr18菌代謝產(chǎn)物處理的線蟲(chóng)體內(nèi)總蛋白質(zhì)量急劇下降，與對(duì)照組線蟲(chóng)的總蛋白質(zhì)含量相比沒(méi)有明顯差異。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，Sr18菌代謝產(chǎn)物處理的線蟲(chóng)體內(nèi)總蛋白質(zhì)含量和對(duì)照組逐漸趨于一致。各項(xiàng)數(shù)據(jù)表明，在短時(shí)間內(nèi)，線蟲(chóng)對(duì)于Sr18菌代謝產(chǎn)物具有一個(gè)明顯的應(yīng)激反應(yīng)，這主要表現(xiàn)為短時(shí)間內(nèi)蛋白質(zhì)大量的合成和降解。

2.2 Sr18菌代謝產(chǎn)物對(duì)SOD活性的影響

Sr18菌代謝產(chǎn)物在不同時(shí)間對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)SOD活性的影響見(jiàn)圖2。由圖2可知，在0～4 h內(nèi)，Sr18菌代謝產(chǎn)物處理的線蟲(chóng)體內(nèi)SOD活性沒(méi)有明顯的變化，但對(duì)照組的SOD活性有一個(gè)明顯升高和下降的改變。在4～8 h內(nèi)Sr18菌代謝產(chǎn)物處理的線蟲(chóng)體內(nèi)SOD活性和相應(yīng)對(duì)照組SOD活性的變化趨勢(shì)基本保持一致。從總體SOD活性高低來(lái)看，Sr18菌代謝產(chǎn)物處理的線蟲(chóng)體內(nèi)SOD活性在處理時(shí)間內(nèi)明顯低于對(duì)照組。這表明，Sr18菌代謝產(chǎn)物具有抑制線蟲(chóng)體內(nèi)SOD活性的功能。

2.3 Sr18菌代謝產(chǎn)物對(duì)CAT活性的影響

Sr18代謝產(chǎn)物在不同時(shí)間對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)CAT活性的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，處理組和對(duì)照組線蟲(chóng)體內(nèi)CAT活性，隨處理時(shí)間的不同在8 h內(nèi)的變化規(guī)律基本相似。即在0～2 h內(nèi)呈上升趨勢(shì)，在2～8 h呈下降趨勢(shì)。在2～4 h內(nèi)處理組與對(duì)照組相比CAT活性急速下降，說(shuō)明Sr18菌代謝產(chǎn)物抑制了CAT的活性，但4 h后，CAT活性的下降趨于平緩，說(shuō)明隨處理時(shí)間的增加CAT活性受抑制程度基本相同即達(dá)到了最大效果。

當(dāng)線蟲(chóng)體內(nèi)的CAT活性被抑制時(shí)，會(huì)使線蟲(chóng)體內(nèi)廣泛存在的活性氧暴增，導(dǎo)致自由基增多，造成對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷，特別是生物膜中不飽和脂肪酸的過(guò)氧化作用導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)過(guò)氧化脂質(zhì)生成，致使細(xì)胞膜的流動(dòng)性降低，核酸和染色體被破壞[10，11]。

2.4 Sr18菌代謝產(chǎn)物對(duì)TChE活性的影響

Sr18菌在不同時(shí)間對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)TChE活性的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，處理組和對(duì)照組的線蟲(chóng)體內(nèi)TChE活性的變化趨勢(shì)基本相同，維持在相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。但處理的線蟲(chóng)體內(nèi)TChE活性始終低于對(duì)照的線蟲(chóng)，這說(shuō)明Sr18菌代謝產(chǎn)物對(duì)TChE有顯著的抑制作用，且隨著時(shí)間的變化，TChE活性受抑制程度基本相同。

2.5 Sr18菌代謝產(chǎn)物對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)ATP酶活性的影響

Sr18代謝產(chǎn)物在不同時(shí)間對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)ATP活性的影響見(jiàn)圖5。由圖5可知，處理組和對(duì)照組的線蟲(chóng)，在0～6 h這段時(shí)間內(nèi)，體內(nèi)ATP酶活性維持在相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。處理組線蟲(chóng)體內(nèi)ATP酶活性低于對(duì)照組，說(shuō)明Sr18代謝產(chǎn)物抑制了ATP酶的活性。但處理的線蟲(chóng)在8 h時(shí)，體內(nèi)ATP酶的活性顯著降低，表明長(zhǎng)時(shí)間處理能更大限度地抑制ATP酶地活性。

3 小結(jié)與討論

3.1 Sr18菌代謝產(chǎn)物對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)蛋白質(zhì)含量有較大影響

Sr18菌代謝產(chǎn)物對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)蛋白質(zhì)含量有重要的影響，在4 h時(shí)，處理組總蛋白質(zhì)含量與對(duì)照組相比有顯著差異，4 h時(shí)處理組比對(duì)照組的線蟲(chóng)明顯活躍，這可能與4 h時(shí)總蛋白質(zhì)的含量陡增有關(guān)。而在其他時(shí)間則基本保持一致，在2～4 h這段時(shí)間內(nèi)處理組線蟲(chóng)在逆境情況下可能發(fā)生相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)，合成某些新的蛋白質(zhì)來(lái)抵抗不利的外界環(huán)境，但隨著處理時(shí)間的增加含量逐漸降低，這可能是處理組線蟲(chóng)體內(nèi)的某些蛋白質(zhì)在代謝產(chǎn)物處理過(guò)程中分解受阻，在體內(nèi)大量積累，但隨著處理時(shí)間的加長(zhǎng)蛋白質(zhì)分解又恢復(fù)正常所造成的。有關(guān)更深層次的原因有待進(jìn)一步研究。

3.2 Sr18菌代謝產(chǎn)物對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)SOD、CAT活性的影響

Sr18菌代謝產(chǎn)物對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響結(jié)果看，處理組和對(duì)照組線蟲(chóng)體內(nèi)SOD活性在8小時(shí)內(nèi)的變化規(guī)律基本相似，即先呈下降趨勢(shì)后呈上升趨勢(shì)。在整個(gè)變化過(guò)程中處理組SOD活性明顯低于對(duì)照組，表明菌代謝產(chǎn)物抑制線蟲(chóng)體內(nèi)SOD的活性。但由于處理后的線蟲(chóng)體內(nèi)的SOD活性受抑制，不能及時(shí)有效的清除氧自由基，從而造成超氧陰離子的大量堆積，對(duì)線蟲(chóng)機(jī)體造成毒性，干擾細(xì)胞正常的生理代謝，從而破壞線蟲(chóng)了抗氧化保護(hù)酶系[12]。

試驗(yàn)結(jié)果表明，Sr18菌代謝產(chǎn)物能顯著抑制線蟲(chóng)的SOD和CAT活性，對(duì)線蟲(chóng)機(jī)體造成毒性，使線蟲(chóng)體內(nèi)廣泛存在的活性氧暴增，導(dǎo)致自由基增多，使細(xì)胞膜產(chǎn)生過(guò)氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜破壞和損傷[10，11]，最終導(dǎo)致線蟲(chóng)死亡。

3.3 Sr18菌代謝產(chǎn)物對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)TChE、ATP酶活性的影響

在Sr18菌代謝產(chǎn)物對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)TChE活性試驗(yàn)中，中毒線蟲(chóng)起初表現(xiàn)為蟲(chóng)體扭曲、顫抖、痙攣，接著線蟲(chóng)游動(dòng)緩慢、扭動(dòng)身軀，最后反應(yīng)遲鈍、偶爾扭動(dòng)身軀，直至死亡，蟲(chóng)體僵直。由此可以推測(cè)，Sr18菌代謝產(chǎn)物對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)TChE活性的顯著抑制，導(dǎo)致乙酰膽堿積累，造成突觸間隙的乙酰膽堿持續(xù)處于高濃度，使突觸后膜上的乙酰膽堿受體長(zhǎng)時(shí)間處于活化狀態(tài)，從而阻斷了神經(jīng)傳遞，引起中毒反應(yīng)[13]。

從試驗(yàn)結(jié)果看，在8 h時(shí)ATP酶活性具有突然顯著降低（ATP酶是能量轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵酶，可分解ATP成ADP和Pi，放出大量的能量），有可能是由乙酰膽堿的積累造成線蟲(chóng)機(jī)體過(guò)度興奮，能量供給不上，造成線蟲(chóng)痙攣、麻痹，影響了線蟲(chóng)體內(nèi)的正常代謝，從而影響其生命力，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致線蟲(chóng)死亡。由此，可推測(cè)Sr18菌代謝物活性物質(zhì)具有神經(jīng)遞質(zhì)抑制作用，這一點(diǎn)從Sr18菌代謝物活性物質(zhì)的室內(nèi)殺線蟲(chóng)活性測(cè)定得到證實(shí)，因?yàn)樽饔糜谏窠?jīng)系統(tǒng)的物質(zhì)，其毒殺作用的特點(diǎn)是快速擊倒和殺死作用，而Sr18菌代謝物活性物質(zhì)對(duì)松材線蟲(chóng)處理24 h死亡率達(dá)100%[6]。

綜上所述，Sr18菌代謝產(chǎn)物的活性物質(zhì)對(duì)這4種酶都有不同程度的抑制作用，這說(shuō)明Sr18菌代謝產(chǎn)物對(duì)線蟲(chóng)的致死作用有可能是綜合性的，是通過(guò)不同方面和不同系統(tǒng)作用的結(jié)果，它們之間是相互關(guān)聯(lián)和相互影響，而有關(guān)更深層次的問(wèn)題有待進(jìn)一步研究。

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在Sr18菌代謝產(chǎn)物對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)TChE活性試驗(yàn)中，中毒線蟲(chóng)起初表現(xiàn)為蟲(chóng)體扭曲、顫抖、痙攣，接著線蟲(chóng)游動(dòng)緩慢、扭動(dòng)身軀，最后反應(yīng)遲鈍、偶爾扭動(dòng)身軀，直至死亡，蟲(chóng)體僵直。由此可以推測(cè)，Sr18菌代謝產(chǎn)物對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)TChE活性的顯著抑制，導(dǎo)致乙酰膽堿積累，造成突觸間隙的乙酰膽堿持續(xù)處于高濃度，使突觸后膜上的乙酰膽堿受體長(zhǎng)時(shí)間處于活化狀態(tài)，從而阻斷了神經(jīng)傳遞，引起中毒反應(yīng)[13]。

從試驗(yàn)結(jié)果看，在8 h時(shí)ATP酶活性具有突然顯著降低（ATP酶是能量轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵酶，可分解ATP成ADP和Pi，放出大量的能量），有可能是由乙酰膽堿的積累造成線蟲(chóng)機(jī)體過(guò)度興奮，能量供給不上，造成線蟲(chóng)痙攣、麻痹，影響了線蟲(chóng)體內(nèi)的正常代謝，從而影響其生命力，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致線蟲(chóng)死亡。由此，可推測(cè)Sr18菌代謝物活性物質(zhì)具有神經(jīng)遞質(zhì)抑制作用，這一點(diǎn)從Sr18菌代謝物活性物質(zhì)的室內(nèi)殺線蟲(chóng)活性測(cè)定得到證實(shí)，因?yàn)樽饔糜谏窠?jīng)系統(tǒng)的物質(zhì)，其毒殺作用的特點(diǎn)是快速擊倒和殺死作用，而Sr18菌代謝物活性物質(zhì)對(duì)松材線蟲(chóng)處理24 h死亡率達(dá)100%[6]。

綜上所述，Sr18菌代謝產(chǎn)物的活性物質(zhì)對(duì)這4種酶都有不同程度的抑制作用，這說(shuō)明Sr18菌代謝產(chǎn)物對(duì)線蟲(chóng)的致死作用有可能是綜合性的，是通過(guò)不同方面和不同系統(tǒng)作用的結(jié)果，它們之間是相互關(guān)聯(lián)和相互影響，而有關(guān)更深層次的問(wèn)題有待進(jìn)一步研究。

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在Sr18菌代謝產(chǎn)物對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)TChE活性試驗(yàn)中，中毒線蟲(chóng)起初表現(xiàn)為蟲(chóng)體扭曲、顫抖、痙攣，接著線蟲(chóng)游動(dòng)緩慢、扭動(dòng)身軀，最后反應(yīng)遲鈍、偶爾扭動(dòng)身軀，直至死亡，蟲(chóng)體僵直。由此可以推測(cè)，Sr18菌代謝產(chǎn)物對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)TChE活性的顯著抑制，導(dǎo)致乙酰膽堿積累，造成突觸間隙的乙酰膽堿持續(xù)處于高濃度，使突觸后膜上的乙酰膽堿受體長(zhǎng)時(shí)間處于活化狀態(tài)，從而阻斷了神經(jīng)傳遞，引起中毒反應(yīng)[13]。

從試驗(yàn)結(jié)果看，在8 h時(shí)ATP酶活性具有突然顯著降低（ATP酶是能量轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵酶，可分解ATP成ADP和Pi，放出大量的能量），有可能是由乙酰膽堿的積累造成線蟲(chóng)機(jī)體過(guò)度興奮，能量供給不上，造成線蟲(chóng)痙攣、麻痹，影響了線蟲(chóng)體內(nèi)的正常代謝，從而影響其生命力，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致線蟲(chóng)死亡。由此，可推測(cè)Sr18菌代謝物活性物質(zhì)具有神經(jīng)遞質(zhì)抑制作用，這一點(diǎn)從Sr18菌代謝物活性物質(zhì)的室內(nèi)殺線蟲(chóng)活性測(cè)定得到證實(shí)，因?yàn)樽饔糜谏窠?jīng)系統(tǒng)的物質(zhì)，其毒殺作用的特點(diǎn)是快速擊倒和殺死作用，而Sr18菌代謝物活性物質(zhì)對(duì)松材線蟲(chóng)處理24 h死亡率達(dá)100%[6]。

綜上所述，Sr18菌代謝產(chǎn)物的活性物質(zhì)對(duì)這4種酶都有不同程度的抑制作用，這說(shuō)明Sr18菌代謝產(chǎn)物對(duì)線蟲(chóng)的致死作用有可能是綜合性的，是通過(guò)不同方面和不同系統(tǒng)作用的結(jié)果，它們之間是相互關(guān)聯(lián)和相互影響，而有關(guān)更深層次的問(wèn)題有待進(jìn)一步研究。

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