姜黃素對(duì)泡沫細(xì)胞膽固醇流出及ABCA1表達(dá)的影響

周娟

（南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 衡陽(yáng)421001）

張大棣

（岳陽(yáng)市第一人民醫(yī)院，湖南 岳陽(yáng)415900）

蔡恒玲

（南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 衡陽(yáng)421001）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，As）是冠心病發(fā)生及嚴(yán)重并發(fā)癥發(fā)生的主要原因。泡沫細(xì)胞的形成作為As發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和典型的病理特征，其貫穿于形成的動(dòng)脈粥樣斑塊整個(gè)過(guò)程，直接關(guān)系A(chǔ)S的發(fā)生發(fā)展［1－2］。蓄積于血管內(nèi)皮下的氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox－LDL）被巨噬細(xì)胞或者平滑肌細(xì)胞吞噬是形成泡沫細(xì)胞的主要階段［3］。膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)（reverse cholesterol transport，RCT）是外周組織清除過(guò)多膽固醇防治脂質(zhì)蓄積抑制動(dòng)脈粥樣硬化的核心機(jī)制，而斑塊中巨噬細(xì)胞膽固醇流出是RCT的重要環(huán)節(jié)之一，因此促進(jìn)巨噬細(xì)胞膽固醇的流出，可以抑制泡沫細(xì)胞的形成，防止斑塊的進(jìn)展，降低冠心病的發(fā)生率［4－5］。ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 A1（ATP－binding cassette transporter A1，ABCA1）是調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其表達(dá)的下調(diào)會(huì)引起細(xì)胞膽固醇流出的減少，導(dǎo)致膽固醇酯在細(xì)胞蓄積，形成泡沫細(xì)胞［6］。因此ABCA1是抑制泡沫細(xì)胞形成重要靶標(biāo)。

姜黃素是從姜黃中提取的一種酚類(lèi)物質(zhì)，為姜黃的最要活性成分。近年來(lái)大量的研究顯示，姜黃素具有抗氧化、抗炎、抗凝、降血脂及抑制腫瘤生長(zhǎng)等作用［7－8］。而且研究已經(jīng)證實(shí)姜黃素對(duì)于大腸癌、乳腺癌、阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）和肝病等具有很好的療效［9－10］。此外，最近有研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以通過(guò)調(diào)節(jié)過(guò)氧化體增殖物激活型受體γ（peroxisome proliferator activated receptorγ，PPAR－γ），抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞白介素（Interleukin1，IL1）和6（Interleukin1，IL1）及單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein－1，MCP－1）表達(dá)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，并且還可通過(guò)調(diào)節(jié)MAPK通路從而抑制巨噬細(xì)胞CD36表達(dá)，發(fā)揮抗As的作用［11］。然而姜黃素對(duì)RCT作用及其機(jī)制尚不明清楚。

本實(shí)驗(yàn)以人單核細(xì)胞株THP－1源性巨噬細(xì)胞為研究的對(duì)象，觀察姜黃素對(duì)ox－LDL誘導(dǎo)THP1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成的影響，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

THP－1人單核細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)；總RNA提取試劑盒（TRIzol）購(gòu)置北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；氧化低密度脂蛋白（ox－LDL）購(gòu)于上海滬尚生物科技有限公司；姜黃素、佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA）購(gòu)于美國(guó) Sigma公司；辣根過(guò)氧化物酶（horseradishperioxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗、羊抗人ABCA1抗體購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司；Real Time－PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Toyobo公司；無(wú)噬菌體胎牛血清購(gòu)于四季青生物有限公司，RPMI－1640培養(yǎng)基購(gòu)于Hyclone，引物是由上海生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)及合成，其余試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) THP－1細(xì)胞用含有10%無(wú)噬菌體FBS的 RPMI 1640培養(yǎng)液（另加入1.0×105μg／L青霉素和100μg／L鏈霉素），置于含5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前預(yù)先用160nmol／L PMA處理細(xì)胞24h，誘導(dǎo)其分化為巨噬細(xì)胞。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 分5組：對(duì)照組（正常巨噬細(xì)胞）、模型組（即泡沫細(xì)胞組）、姜黃素（1×10－6、1×10－5、1×10－4mol／L）處理組。對(duì)照組只加入RPMI1640培養(yǎng)液，模型組在RPMIl640培養(yǎng)液另加入50mg／L ox－LDL共同孵育48h；姜黃素處理組在RPMIl640培養(yǎng)液中加入不同濃度姜黃素（1×10－6、1×10－5、1×10－4mol／L）和50mg／L ox－LDL孵育細(xì)胞48h。

1.2.3 油紅O染色 參考文獻(xiàn) ［12］的方法。

1.2.4 高效液相色譜法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯含量 參考文獻(xiàn) ［13］的方法。

1.2.5 膽固醇流出測(cè)定 參考文獻(xiàn) ［13］的方法。膽固醇和磷脂流出率（%）＝［培養(yǎng)液中3H／總3H（培養(yǎng)液＋細(xì)胞內(nèi)）］×100%。

1.2.6 Western blot 收集各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞的總蛋白，并用BAC試劑盒（按說(shuō)明書(shū)操作）測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，用鼎國(guó)生物技術(shù)公司的SDS－PAGE凝膠試劑盒按說(shuō)明書(shū)配置5%濃縮膠和8%分離膠進(jìn)行電泳，每孔的上樣量50μg，條件恒壓80V20min，150V60min，電泳完畢后根據(jù)mark顯示，切取相應(yīng)膠帶進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜前PVDF膜甲醇浸泡15min，轉(zhuǎn)膜條件為恒流220mA 2h，隨后用5%牛奶（TBST配置）封閉6h，加一抗（1∶2000）過(guò)夜，后TBST洗膜3遍，每次10min；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗（1∶2000）室溫1.5h，PBS清洗3遍，每次10min。后用Tanon ECL熒光檢查儀，對(duì)結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果用AlphaImager 2200圖像分析軟件進(jìn)行分析，將各組細(xì)胞的ABCA1光密度值分別與內(nèi)參β－actin光密度值進(jìn)行比較，所得比值代表ABCA1蛋白的表達(dá)水平。

1.2.7 Real time－PCR 收集各組細(xì)胞，按康為的Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，分光光度計(jì)法標(biāo)化RNA（A260／A280），按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟，每20μl取1.5μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件為：35℃，10min，70℃，8s；再取2.5μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，反應(yīng)體系為25μl，以β－actin為內(nèi)參。引物如下：ABCA1的引物序列：上游5'－TCC AGG CCA GTA CGG AAT TC－3'，下游5'－ACT TTC CTC GCC AAA CCA GTA G－3'，引物長(zhǎng)度71bp。PCR 反應(yīng)條件：50℃ 3min，95℃6min，95℃15s，55℃25s，75℃30s，共40個(gè)循環(huán)。用ΔΔCt來(lái)計(jì)算基因的表達(dá)水平，計(jì)算公式如下：ΔCt＝目的基因Ct值－β－actin基因Ct值；ΔΔCt＝實(shí)驗(yàn)組ΔCt－對(duì)照組ΔCt；實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組基因表達(dá)水平的倍數(shù)＝2－ΔΔCt。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對(duì)THP1巨噬細(xì)胞泡沫化的影響

用油紅O染色后，顯微鏡下觀察顯示，與對(duì)照組相比，泡沫細(xì)胞組由于細(xì)胞攝取大量的ox－LDL導(dǎo)致胞內(nèi)脂質(zhì)堆積，油紅O染色陽(yáng)性細(xì)胞遍布視野，脂點(diǎn)呈花環(huán)狀位于細(xì)胞核周，而1×10－5mol／L及1×10－4mol／L姜黃素處理組，油紅O染色陽(yáng)性細(xì)胞比細(xì)胞模型組明顯減少；而10－6mol／L姜黃素處理組的細(xì)胞與模型組相比無(wú)明顯差異（見(jiàn)圖1）。

圖1 FGF21對(duì)泡沫細(xì)胞形成的影響（×400）

2.2 姜黃素對(duì)THP1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇及膽固醇酯含量的影響

與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)TC、FC和CE含量明顯增高（P＜0.05），CE／TC值為63.93%，與對(duì)照組有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組相比，1×10－5mol／L及1×10－4mol／L姜黃素處理組細(xì)胞內(nèi)TC、FC、CE含量及CE／TC均有明顯差異（P＜0.05）。而1×10－6mol／L姜黃素處理組TC、FC、CE以及CE／TC與模型組相比無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 姜黃素對(duì)THP1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇及膽固醇酯含量的影響

2.3 姜黃素對(duì)THP1源性巨噬細(xì)胞膽固醇流出的影響

為了進(jìn)一步證明姜黃素對(duì)THP1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞膽固醇代謝的影響，我們檢測(cè)了各組細(xì)胞的膽固醇流出率。與對(duì)照組（9.52%±1.94%）相比，模型組細(xì)胞（19.75%±1.85%）的膽固醇流出率明顯增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。與模型組相比，1×10－5mol／L（32.07%±2.86%）及1×10－4mol／L（42.56±2.76%）姜黃素處理組細(xì)胞的膽固醇流出率明顯增加（P＜0.01），而1×10－4mol／L姜黃素組與模型組相比膽固醇流出率并無(wú)明顯差別；1×10－6mol／L姜黃素處理組細(xì)胞的膽固醇流出率為（20.93%±2.73%），與模型組細(xì)胞無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.4 姜黃素對(duì)THP1源性巨噬細(xì)胞ABCA1mRNA和蛋白表達(dá)的影響

Real time－PCR及Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，泡沫化的巨噬細(xì)胞ABCA1mRNA及蛋白表達(dá)明顯增高（見(jiàn)圖2）。與模型組相比，1×10－5mol／L和1×10－4mol／L姜黃處理組細(xì)胞內(nèi)的ABCA1的mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加（均P＜0.05），而1×10－6mol／L姜黃素處理組與模型組相比，ABCA1的mRNA和蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異。

圖2 姜黃素對(duì)THP1源性巨噬細(xì)胞ABCA1表達(dá)的影響

3 討論

As的發(fā)生和進(jìn)展是引起各種心腦血管疾病重要的病理生理基礎(chǔ)，防止動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生對(duì)預(yù)防各種心腦血管疾病具有重要的意義［14］。泡沫細(xì)胞的形成作為AS發(fā)生的核心環(huán)節(jié)，關(guān)系到斑塊的穩(wěn)定和急性臨床事件的發(fā)生。因此，預(yù)防泡沫細(xì)胞的形成成為了預(yù)防AS發(fā)生進(jìn)展的主要策略［2］。膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(yùn)作為外周組織轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞多余膽固醇主要途徑，是防止脂質(zhì)在外周組織蓄積的重要手段，是對(duì)抗AS發(fā)生的重要機(jī)制。ABCA作為調(diào)控膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的重要蛋白，其表達(dá)的上調(diào)可以促進(jìn)泡沫細(xì)胞膽固醇的代謝，脂質(zhì)流出，抑制泡沫細(xì)胞形成［2，15］。

姜黃素是從姜黃中提取出來(lái)的天然色素，具有抗炎、抗氧化、降脂等作用［7－8］?，F(xiàn)有的國(guó)內(nèi)外研究證明，姜黃素不僅對(duì)心肌有保護(hù)作用，同時(shí)也能通過(guò)上調(diào)ABCA1表達(dá)調(diào)控小鼠的認(rèn)知功能，這表明姜黃素具備改善AD的潛能［16－17］。而最新的研究顯示姜黃素可以抑制動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，但是具體的機(jī)制不明。Hasan等研究顯示在LDLR－／－小鼠中姜黃素可以抑制脂肪酸結(jié)合蛋白以及CD36表達(dá)，繼而抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的的進(jìn)展。Siddiqui等發(fā)現(xiàn)姜黃素可以通過(guò)調(diào)控NF－κB信號(hào)通路抑制炎癥因子（如IL－6、IL－8、MCP1、TNFα）等的表達(dá)［18］。此外，姜黃素還可以通過(guò)影響PPARγ的表達(dá)降低單核細(xì)胞趨化蛋白－1（MCP－1）、內(nèi)皮素、血管細(xì)胞黏附分子－1（VCAM－1）的表達(dá)，抑制白細(xì)胞介素－6（IL－6）釋放，并抑制了NF－κB的活性等發(fā)揮拮抗慢性炎癥的作用，從而抑制As的進(jìn)展［19］。而Jain科研團(tuán)隊(duì)在糖尿病動(dòng)物模型及相關(guān)的細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)中也表明了姜黃素具有抗炎作用［20］。這些研究結(jié)果表明姜黃素具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的潛能，而這也得到了廣泛研究的證實(shí)，但是關(guān)于姜黃素在泡沫細(xì)胞膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用，尚未見(jiàn)研究報(bào)道?；诖耍覀儗?duì)姜黃素對(duì)泡沫細(xì)胞形成及其內(nèi)膽固醇代謝進(jìn)行研究，從AS發(fā)生的核心環(huán)節(jié)上，觀察姜黃素的作用，為姜黃素在防治AS的研究提供新的理論依據(jù)。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)，我們可以看出，姜黃素可以減少THP1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞膽固醇的流出，減少膽固醇的蓄積。此外，我們的結(jié)果還顯示姜黃素可以上調(diào)ABCA1表達(dá)，而ABCA1作為調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出的重要蛋白，其表達(dá)的上調(diào)可以促進(jìn)泡沫細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇的流出，抑制泡沫細(xì)胞的形成。LXRα、PPARγ、cAMP作為調(diào)節(jié)ABCA1表達(dá)的重要因子，它們對(duì)ABCA1表達(dá)的調(diào)控已經(jīng)得到廣泛的認(rèn)同，因此通過(guò)調(diào)控LXRα、PPARγ、cAMP表達(dá)可以調(diào)節(jié)ABCA1從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞膽固醇的流出，防止斑塊的進(jìn)展［21］。而最近研究顯示，在脂肪細(xì)胞中姜黃素可以通過(guò)PPARγ－LXRα－ABCA1途徑促進(jìn)脂肪細(xì)胞的膽固醇的流出，這表明姜黃素確實(shí)可以激活PPARγ－LXRα通路［22］。在本研究中我們只是初步的確探討黃素素對(duì)泡沫細(xì)胞的影響及機(jī)制，而關(guān)于姜黃素是否通過(guò)激活PPARγ－LXRα通路調(diào)節(jié)ABCA1表達(dá)的工作目前正在開(kāi)展。通過(guò)目前我們的研究結(jié)果表明，姜黃素可以明顯的上調(diào)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞ABCA1的表達(dá)，從而介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出，抑制泡沫細(xì)胞形成和發(fā)展。因此，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研究我們得出姜黃素可以上調(diào)THP1源性巨噬細(xì)胞泡沫細(xì)胞內(nèi)ABCA1表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的外流，抑制泡沫細(xì)胞的形成。而這為姜黃素在心血管領(lǐng)域的運(yùn)用及AS藥物的研究提供新的方向。

［1］Randolph GJ.Mechanisms that regulate macrophage burden in atherosclerosis ［J］.Circ Res，2014，114（11）：1757－1771.

［2］Yu XH，F(xiàn)u YC，Zhang DW，et al.Foam cells in atherosclerosis ［J］.Clin Chim Acta，2013，424：245－252.

［3］Tian L，Luo N，Klein RL，et al.Adiponectin reduces lipid accumulation in macrophage foam cells ［J］.Atherosclerosis，2009，202（1）：152－161.

［4］Iizuka M，Ayaori M，Uto－Kondo H，et al.Astaxanthin enhances ATP－binding cassette transporter A1／G1expressions and cholesterol efflux from macrophages ［J］.J Nutr Sci Vitaminol（Tokyo），2012，58（2）：96－104.

［5］Yvan－Charvet L，Wang N，Tall AR.Role of HDL，ABCA1，and ABCG1transporters in cholesterol efflux and immune responses［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2010，30（2）：139－143.

［6］Lee J，Park Y，Koo SI.ATP－binding cassette transporter A1and HDL metabolism：effects of fatty acids ［J］.J Nutr Biochem，2012，23（1）：1－7.

［7］Dulbecco P，Savarino V.Therapeutic potential of curcumin in digestive diseases ［J］.World J Gastroenterol，2013，19（48）：9256－9270.

［8］Brietzke E，Mansur RB，Zugman A，et al.Is there a role for curcumin in the treatment of bipolar disorder？［J］.Med Hypotheses，2013，80（5）：606－612.

［9］Monroy A，Lithgow GJ，Alavez S.Curcumin and neurodegenerative diseases ［J］.Biofactors，2013，39（1）：122－132.

［10］Vyas A，Dandawate P，Padhye S，et al.Perspectives on new synthetic curcumin analogs and their potential anticancer properties［J］.Curr Pharm Des，2013，19（11）：2047－2069.

［11］Chen F，Guo N，Cao G，et al.Molecular analysis of curcumin－induced polarization of murine RAW264.7macrophages ［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2014，63（6）：544－552.

［12］歐陽(yáng)新平，周壽紅，田紹文，等.檳榔堿對(duì)泡沫細(xì)胞膽固醇流出和ABCA1表達(dá)的影響 ［J］.中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2012，20（4）：289－294.

［13］Liu XY，Lu Q，Ouyang XP，et al.Apelin－13increases expression of ATP－binding cassette transporter A1via activating protein kinase Cαsignaling in THP－1macrophage－derived foam cells ［J］.Atherosclerosis，2013，226（2）：398－407.

［14］Hansson GK.Inflammation，atherosclerosis，and coronary artery disease ［J］.N Engl J Med，2005，352（16）：1685－1695.

［15］de la Llera－Moya M，Drazul－Schrader D，Asztalos BF，el at.The ability to promote efflux via ABCA1determines the capacity of serum specimens with similar high－density lipoprotein cholesterol to remove cholesterol from macrophages ［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2010，30（4）：796－801.

［16］高秋，楊松，陳燕春，等.姜黃素對(duì)阿霉素致大鼠心臟毒性的保護(hù)作用及機(jī)制探討 ［J］.山東醫(yī)藥，2014，54（16）：27－29.

［17］滕志朋，王晨，張雄，等.姜黃素對(duì)APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠海馬ABCA1、apoA1的表達(dá)和血清TC、HDL含量的影響 ［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，39（2）：146－149.

［18］Hasan ST，Zingg JM，Kwan P，et al.Curcumin modulation of high fat diet－induced atherosclerosis and steatohepatosis in LDL receptor deficient mice ［J］.Atherosclerosis，2014，232（1）：40－51.

［19］Siddiqui AM，Cui X，Wu R，et al.The anti－inflammatory effect of curcumin in an experimental model of sepsis is mediate d by up－regulation of peroxisome proliferator－activated receptor－γ ［J］.Crit Care Med，2006，34（7）：1874－1882.

［20］Jain SK，Rains J，Croad J，et al.Curcumin supplementa－tion lowers TNF－α，IL－6，IL－8，and MCP－1secretion in high glucose－treated cultured monocytes and blood levels of TNF－alpha，IL－6，MCP－1，glucose and glycosylated hemoglobin in diabetic rats［J］.Antioxid Redox Signal，2009，11（2）：241－249.

［21］Schmitz G，Langmann T.Transcriptional regulatory networks in lipid metabolism control ABCA1expression a ［J］.Biochim Biophys Act，2005，1735（1）：1－19.

［22］Dong SZ，Zhao SP，Wu ZH，et al.Curcumin promotes cholesterol efflux from adipocytes related to PPARgamma－LXRalpha－ABCA1 passway ［J］.Mol Cell Biochem，2011，358（1／2）：281－285.