美國藥典、中國藥典、英國藥典熱原檢測方法的比較

方菁嶷 梁羽 李新寅

熱原(pyrogen)系指能引起恒溫動物體溫異常升高的致熱物質(zhì)。它包括細(xì)菌性熱原、內(nèi)源性高分子熱原、內(nèi)源性低分子熱原及化學(xué)熱原等。熱原檢測方法有兩種, 分別是家兔法和內(nèi)毒素檢測法。家兔法系將一定劑量的供試品, 靜脈注入家兔體內(nèi), 在規(guī)定時間內(nèi), 觀察家兔體溫升高的情況, 以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定的一種方法。內(nèi)毒素法是通過鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素的方法, 此法雖然簡單、快速但對內(nèi)毒素以外的熱原不靈敏。因此家兔法是一種重要的不可替代的熱原檢測方法。美國藥典、中國藥典、英國藥典對家兔熱原檢測方法都有詳細(xì)闡述, 為了了解三種方法的區(qū)別, 作者用這三種方法對同一款產(chǎn)品進行了檢測和評價。

1 試驗材料

試驗樣品：某公司生產(chǎn)的生理鹽水；試驗動物：新西蘭純種大白兔；動物來源：蘇州高新區(qū)鎮(zhèn)湖實驗動物科技有限公司 SCXK(蘇)2013-0002；飼料：實驗兔全價顆粒飼料(無錫實驗動物廠)；水：自來水(符合GB 5749-2006衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn))；室溫：17～25℃；相對濕度：40%～70%；光照:每天需要12小時光照(全光譜日光燈)；選擇健康未使用過的動物；人員：有相應(yīng)檢測資質(zhì)的檢測人員。

2 試驗步驟

2.1 動物選擇

2.1.1 英國藥典：試驗前2 d預(yù)測體溫, 自耳緣靜脈注入38.5℃的無熱原生理鹽水, 劑量10 ml/kg；從注射前至少90 min開始每隔30 min測量體溫1次, 直至注射后3 h；體溫變化不超過0.6℃可以用于實驗。

2.1.2 中國藥典：試驗前3 d預(yù)測體溫；每隔30 min測量體溫1次, 共測8次；8次體溫均在38.0～39.6℃的范圍內(nèi),且單個兔最高與最低體溫相差不超過0.4℃可以用于試驗。

2.1.3 美國藥典：試驗前3 d預(yù)測體溫；每隔30 min測量體溫1次, 共測8次；8次體溫均未超過39.8℃可以用于試驗。

2.2 基礎(chǔ)體溫確定

2.2.1 英國藥典：在開始注射前40 min 內(nèi), 每隔30 min測量體溫1 次, 共測量2 次, 確定初始溫度的2次測量溫差不超過0.2℃；以此2次體溫的平均值作為該兔的初始體溫；組內(nèi)動物體溫差異≤1℃, 初始體溫均在38.0～39.8℃之間可繼續(xù)試驗。

2.2.2 中國藥典：每隔30 min測量體溫1 次, 測量2 次,2次體溫之差不得超過0.2℃, 以此2次體溫的平均值作為該兔的正常體溫；組內(nèi)動物體溫差異≤1℃, 體溫均在38.0～39.6℃之間可繼續(xù)試驗。

2.2.3 美國藥典：每隔30 min測量體溫1 次, 測量2 次, 以此2次體溫的平均值作為該兔的正常體溫。組內(nèi)動物體溫差異≤1℃, 體溫均不超過39.8℃, 繼續(xù)試驗。

2.3 給藥

2.3.1 英國藥典：在4 min內(nèi)自耳緣靜脈注入38.5℃的試驗樣品溶液, 劑量10 ml/kg, 從注射前100 min開始每隔30 min測量體溫1次, 直至注射后3 h。

2.3.2 中國藥典：測量正常體溫15 min以內(nèi)自耳緣靜脈注入規(guī)定劑量(10 ml/kg)并溫?zé)嶂?8℃的試驗樣品, 然后每隔30 min測量其體溫1次。

2.3.3 美國藥典：在10 min內(nèi)自耳緣靜脈注入溫?zé)嶂?37±2)℃的試驗樣品, 劑量10 ml/kg, 然后每隔30 min測量其體溫1次。

2.4 確定體溫升高數(shù)

2.4.1 英國藥典：注射后3 h內(nèi)最高的1次體溫減去初始體溫, 即為該兔體溫的變化數(shù)(℃)。

2.4.2 中國藥典：同英國藥典。

2.4.3 美國藥典：同英國藥典。

2.5 判定標(biāo)準(zhǔn)

2.5.1 英國藥典：當(dāng)試驗兔變化為負(fù)值時以0℃計；用3只兔子進行實驗, 必要時加測3只, 總數(shù)不超過四批共計12只；對應(yīng)實驗動物數(shù), 如果體溫上升總和不超過表1第2列,結(jié)果可接受；對應(yīng)實驗動物數(shù), 如果體溫上升總和大于表1第2列, 但小于表1第3列, 按要求加測；對應(yīng)實驗動物數(shù),如果體溫上升總和大于表1第3列, 該實驗樣品未通過熱原試驗。見表1。

2.5.2 中國藥典：當(dāng)試驗兔變化為負(fù)值時以0℃計；在初試的3只試驗兔中, 體溫升高均低于0.6℃, 并且3只試驗兔

體溫升高總和低于1.3℃, 符合規(guī)定, 否則需進行復(fù)試；在復(fù)試的5只試驗兔中, 體溫升高0.6℃或0.6℃以上的試驗兔不超過1只, 并且初試、復(fù)試合并8只試驗兔的體溫升高總和為3.5℃或3.5℃以下, 判試驗樣品的熱原檢查符合規(guī)定, 否則不符合規(guī)定。

2.5.3 美國藥典：當(dāng)試驗兔變化為負(fù)值時以0℃計；初試的3只試驗兔中, 體溫升高均低于0.5℃；初試時任一動物體溫升高均超過0.5℃, 則選擇5只試驗動物復(fù)試, 在試驗的8只兔中, 體溫升高0.5℃或0.5℃以上的試驗兔不超過3只,并且8只試驗兔的體溫升高總和≤3.3℃, 判試驗樣品的熱原檢查符合規(guī)定, 否則不符合規(guī)定。

3 結(jié)果

3.1 英國藥典試驗結(jié)果, 見表2。

3.2 中國藥典試驗結(jié)果, 見表3。

3.3 美國藥典試驗結(jié)果, 見表4。

表1 評價標(biāo)準(zhǔn)

表2 英國藥典試驗結(jié)果

表3 中國藥典試驗結(jié)果

表4 美國藥典試驗結(jié)果

3.4 結(jié)果分析

3.4.1 英國藥典：3只試驗兔體溫變化總和超過1.15℃, 需要復(fù)測或判為不符合英國藥典要求。

3.4.2 中國藥典：3只試驗兔體溫變化總和<1.3℃, 并且體溫升高均低于0.6℃, 判符合中國藥典要求。

3.4.3 美國藥典：單個試驗兔體溫升高達(dá)到0.5℃, 需要復(fù)測或判為不符合美國藥典要求。

4 討論

從試驗方法分析, 在動物選擇方面, 英國藥典預(yù)測體溫前需注射無熱原生理鹽水, 而中國藥典和美國藥典只需直接測量, 前者共測量10次, 后兩者只需測8次, 明顯英國藥典在動物選擇方面要求高的多；后兩者相比, 中國藥典又要比美國藥典要求高, 因為中國藥典規(guī)定了允許的體溫區(qū)間38.0～39.6℃, 并且單個兔最高與最低體溫相差不超過0.4℃,而美國藥典僅要求8次體溫均未超過39.8℃即可。在基礎(chǔ)體溫確定方面, 三個方法的要求基本一致；但中國藥典在允許的體溫區(qū)間要求方面比美國藥典要高。英國藥典規(guī)定的給藥速度快, 供試品的溫度高；美國藥典對供試品溫度的要求相對可操作性強一點, 規(guī)定了(37±2)℃的區(qū)間, 而且給藥速度也較慢。確定體溫升高數(shù)方面三種方法一致。英國藥典的判定標(biāo)準(zhǔn)最復(fù)雜, 加測的機會也多, 共計可以檢測到12只兔子, 但沒有規(guī)定單個兔子體溫升高的限值；中國藥典和美國藥典都給出了單個兔子體溫升高的限值, 但前者比后者寬松0.1℃, 復(fù)測后體溫升高總數(shù)限值前者比后者寬松0.2℃；但值得一提的是初始的3只兔子體溫升高總數(shù)限值英國藥典要求最高, 要求不超過1.15℃, 中國藥典要求不超過1.3℃, 而美國藥典只規(guī)定單個試驗兔的體溫升高上限, 就這一點來說英國藥典要求是最高的。

從結(jié)果分析, 發(fā)現(xiàn)表1雖然不符合英國藥典的要求, 但符合中國藥典和美國藥典的要求；表2符合中國藥典的要求但不符合美國藥典及英國藥典的要求；表3不符合美國藥典的要求但符合中國藥典的要求。也就是說同一款產(chǎn)品用不同的藥典方法做檢測完全有可能得到不同的結(jié)論。

綜上所述, 不同的藥典試驗方法雖大同小異, 但動物入選、給藥方式、判定標(biāo)準(zhǔn)的差異完全有可能導(dǎo)致同一款產(chǎn)品按照不同的藥典方法得出不同的結(jié)果, 要根據(jù)試驗樣品的來源、使用人群、銷售途徑等謹(jǐn)慎選擇試驗方法。

［1］British Pharmacopoeia Commission Office.BP2007.London: The Stationery Office, 2007 (Appendix XIV D):359.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部).北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2010:附錄XI.

［3］The united states Pharmacopeial convention.USP 2003, U.S.A.:United Stated Pharmacopeial Convention, 2003:USP34-NF29.