柴胡龍牡湯對(duì)小鼠Lewis肺癌的實(shí)驗(yàn)研究

黃 艷，劉 鑫，廖端芳

(1.南華大學(xué)，湖南衡陽(yáng) 421001;2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科，湖南衡陽(yáng) 421001;3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)沙 410208)

肺癌是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一，無(wú)論是發(fā)病率還是死亡率均居全球癌癥首位，其中75% 為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。由于缺乏早期的診斷方法，大多數(shù)患者在診斷時(shí)已是局部晚期，即使完全切除仍有相當(dāng)部分出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移［1］。單純手術(shù)治療的5年生存率為20% ～25%［2］，單純根治性手術(shù)獲益亦有限［3］，即使有手術(shù)切除機(jī)會(huì)也有部分患者拒絕手術(shù)。放射療法是晚期患者的主要治療方法，但常規(guī)放療療效差，且其不良反應(yīng)大，5年生存率僅為10%左右［4］。以內(nèi)皮抑制素為主的新型聯(lián)合放化療雖能抑制腫瘤血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移，使腫瘤細(xì)胞凋亡且不產(chǎn)生耐藥，但也有毒副作用［5］。近年來(lái)，中藥在治療非小細(xì)胞肺癌方面以其可靠的療效顯示出良好的趨勢(shì)，柴胡龍牡湯在臨床上治療非小細(xì)胞肺癌有肯定的療效［6］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)柴胡龍牡湯治療Lewis肺癌的作用和毒副反應(yīng)進(jìn)行了研究和觀察。

1 材料與方法

1.1 藥物

柴胡龍牡湯組成:柴胡12 g，黃芩15 g，法半夏15 g，黨參10 g，茯苓20 g，合歡皮20 g，鉤藤12 g，炒酸棗仁30 g，郁金15 g，生龍骨30 g，生牡蠣30 g，石菖蒲12 g，炙甘草8 g。藥物煎煮2次，分別加10倍或8倍的水煎煮60 min或40 min，合并煎液過(guò)濾后濃縮至生藥1.0 g/mL，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?］。

1.2 動(dòng)物

C57BL/6J近交系小鼠40只，鼠齡6周，體質(zhì)量(20±2)g，SPF級(jí)雌雄各20只，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(許可證號(hào) SCXK(京)2006-0009，質(zhì)量合格證編號(hào)0230988)。

1.3 試劑

Lewis肺癌細(xì)胞株(Lewis lung cancer cells)由中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞中心免疫實(shí)驗(yàn)室提供。MTT法試劑盒、ELISA法IFN-α試劑盒和ELISA法IL-10試劑盒由上海生物工程有限公司提供。

1.4 儀器

CHD型光學(xué)顯微鏡(日本 Olympus)，SpectraMax M5型酶標(biāo)儀(美國(guó) Molecular Devic)，Biofuge Stratos型低溫高速離心機(jī)(德國(guó)heraeus公司)、產(chǎn)品圖像采集及圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)BioRad)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，在每只小鼠皮下注射培養(yǎng)Lewis肺癌細(xì)胞株0.2 mL，5 d后將造模成功的40只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成柴胡龍牡組、模型組、順鉑放射組和恩度聯(lián)合NP組4組。柴胡龍牡組小鼠給予柴胡龍牡湯400 mg/d(0.4 mL/d，含生藥 0.4 g)［8］，模型組小鼠給予生理鹽水 0.4 mL/d灌胃，順鉑化療組實(shí)施順鉑治療每天1 mg/kg，以上各組每天治療1次，持續(xù)2周。恩度聯(lián)合NP組于第1、8天長(zhǎng)春瑞賓(NVB)25 mg/m2靜脈推注，第1天順鉑(CDDP)80 mg/m2靜脈推注，每天給予恩度15 mg靜脈滴注。靜脈滴注治療結(jié)束后處死動(dòng)物，取出肺臟的腫瘤組織，去除小鼠的肺組織進(jìn)行稱重，固定于4%的多聚甲醛中，觀察計(jì)數(shù)每只小鼠肺組織轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的個(gè)數(shù);取處于對(duì)數(shù)增殖期的Lewis肺癌細(xì)胞給予1∶100稀釋的柴胡龍牡湯藥湯，模型組、順鉑放射組、恩度聯(lián)合NP組給予同樣稀釋度的生理鹽水，分別于加藥后0 d、1 d、2 d、3 d測(cè)量進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量之前，在每孔加 MTT50 μL(5 mg/mL)，于37℃、95%O2、5%CO2的培養(yǎng)箱孵育 4 h，加 150 μL DMSO，室溫振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD570的吸光度值;在小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液中加入100 μL1640培養(yǎng)液(含ConA)，在50 mL/L二氧化碳濃度、37℃的培養(yǎng)箱條件下進(jìn)行36 h的培養(yǎng)，取上清液用ELISA法測(cè)定IFN-γ和IL-10含量。

2 結(jié)果

2.1 給藥前后小鼠質(zhì)量的變化

表1顯示，造模成功后給藥2周，模型組質(zhì)量沒(méi)有明顯變化，柴胡龍牡湯組質(zhì)量較之前明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;順鉑化療對(duì)照組和恩度聯(lián)合NP對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量明顯減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 給藥前后小鼠質(zhì)量變化(±s)

表1 給藥前后小鼠質(zhì)量變化(±s)

注:與模型組比較:P＜0.05，柴胡龍牡湯組質(zhì)量明顯增加

組別 劑量(mg/d)樣本數(shù)(n)給藥前質(zhì)量(g)給藥后質(zhì)量(g)R順鉑化療對(duì)照組400 10 20.01 ±0.21 22.32 ±1.97 1.115 0.02 10 20.00 ±0.22 15.33 ±0.45 4.671恩 度 聯(lián) 合 NP 對(duì) 照 組 15.00 10 19.54 ±0.25 16.01 ±0.33 3.820模 型 組 400 10 9.32 ±0.24 20.19 ±2.13 1.045柴胡龍牡湯組

2.2 4組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤的質(zhì)量變化

表2顯示，以模型組為對(duì)照，柴胡龍牡湯組、順鉑化療組、恩度聯(lián)合NP組動(dòng)物的腫瘤質(zhì)量均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說(shuō)明柴胡龍牡湯、順鉑化學(xué)治療和恩度聯(lián)合NP治療均能抑制腫瘤組織的增殖。柴胡龍牡湯組的抑瘤率(36.9%)＜順鉑化療組(45.7%)＜恩度聯(lián)合NP治療組(46.3%)，說(shuō)明柴胡龍牡湯的抑制腫瘤功效小于順鉑治療法和恩度聯(lián)合NP治療法。抑瘤率=(1－柴胡龍牡湯組腫瘤質(zhì)量/模型對(duì)照組腫瘤質(zhì)量)×100%。

2.3 3組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)比較

表3顯示，以模型組為對(duì)照，柴胡龍牡湯組、順鉑放射組和恩度聯(lián)合NP治療組動(dòng)物的腫瘤肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說(shuō)明柴胡龍牡湯和順鉑化學(xué)治療均能抑制腫瘤肺組織的轉(zhuǎn)移。柴胡龍牡組的轉(zhuǎn)移抑制率(29.3%)＜順鉑放射組(44.6%)＜恩度聯(lián)合NP治療組(46.3%)，說(shuō)明柴胡龍牡湯抑制腫瘤肺轉(zhuǎn)移的功效小于順鉑化學(xué)療法和恩度聯(lián)合NP治療法。腫瘤轉(zhuǎn)移抑制率=(1－柴胡龍牡湯組平均每只小鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)個(gè)數(shù)/對(duì)照組每只小鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)個(gè)數(shù))×100%。

表2 4組實(shí)驗(yàn)小鼠瘤重和抑瘤率(±s)

表2 4組實(shí)驗(yàn)小鼠瘤重和抑瘤率(±s)

注:與模型組比較:T=3.789，P=0.001，柴胡龍牡湯組肺腫瘤質(zhì)量明顯減少

組別 劑量(mg/d)樣本數(shù)(n)出瘤情況(n)瘤重(g)抑瘤率(%)順 鉑 放 射 對(duì) 照 組0.02 10 9 1.61 ± 0.71 45.7恩 度 聯(lián) 合 NP 對(duì) 照 組 15 10 10 1.57± 0.37 46.3模型組 400 10 10 2.88± 0.50 —400 10 10 1.82 ± 0.91 36.9柴胡龍牡湯組

2.4 柴胡龍牡湯和模型組細(xì)胞增殖能力比較

表4顯示，柴胡龍牡湯組肺癌細(xì)胞的數(shù)量在第2天和第3天明顯少于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

表3 柴胡龍牡湯對(duì)小鼠肺轉(zhuǎn)移灶的影響(±s)

表3 柴胡龍牡湯對(duì)小鼠肺轉(zhuǎn)移灶的影響(±s)

注:與模型組比較:T=2.268，P=0.032，柴胡龍牡湯組肺腫瘤轉(zhuǎn)移灶/只明顯減少

組別 劑量(mg/d)樣本數(shù)(n)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶的樣本(n)轉(zhuǎn)移灶(個(gè)/只)轉(zhuǎn)移抑制率(%)順鉑化療對(duì)照組400 10 10 1.62 ±1.21 29.3 0.02 10 8 0.78 ±2.24 44.6恩 度 聯(lián) 合 NP 對(duì) 照 組 15 10 7 0.72 ±2.12 48.2模 型 組 400 10 10 3.98 ±3.56 —柴胡龍牡湯組

表4 MTT檢測(cè)2組處理對(duì)于細(xì)胞增殖能力的影響OD570，±s

表4 MTT檢測(cè)2組處理對(duì)于細(xì)胞增殖能力的影響OD570，±s

注:*P＜0.05，表示加藥處理后第2天和第3天柴胡龍牡湯組肺癌細(xì)胞數(shù)明顯少于模型組

組別 劑量(mg/d)0 d 1 d 2 d 3 d模型組0.89 0.011 0.02 400 0.23 ±0.32 0.30 ±0.13 0.74 ±0.10 0.85 ±0.12柴胡龍牡湯組 400 0.23 ±0.33 0.28 ±0.22 0.32 ±0.13* 0.34 ±0.23*t—0.135 4.435 3.405 P—

2.5 3組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血小板、紅細(xì)胞、白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血紅蛋白比較

表5顯示，柴胡龍牡湯組的血小板紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血紅蛋白和模型組、順鉑化療組、恩度聯(lián)合NP治療組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，4組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中性細(xì)胞比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表5 4組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物治療前后的血小板、紅細(xì)胞、白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血紅蛋白比較(±s)

表5 4組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物治療前后的血小板、紅細(xì)胞、白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血紅蛋白比較(±s)

注:*P＜0.05，表示柴胡龍牡湯治療后血小板紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血紅蛋白與模型組、順鉑化療組、恩度聯(lián)合NP治療組比較，柴胡龍牡湯組對(duì)上述指標(biāo)無(wú)明顯影響

組別 劑量(mg/d)樣本數(shù)(n)時(shí) 間 WBC(×109/L)中性粒細(xì)胞(×109/L)Pt(×109/L)RBC(×1012/L)HGB(g/L)順 鉑 化 療 對(duì) 照 組 0.02 10 治療前 7.63 ±1.41 5.46 ±1.59 133.46 ±23.68 3.61 ±0.34116.31 ± 8.48治療后 15.11 ±2.65 8.31 ± 5.29 60.82 ± 17.71 6.41 ±3.24 162.23 ±11.9恩度聯(lián)合NP對(duì)照組 15 10 治療前 7.98±1.23 5.68 ±1.48 137.23±21.65 3.67±0.58 116.22± 5.43治療后 14.22 ±2.11 8.23 ±4.08 80.47 ±18.10 5.43 ±2.27 155.21 ± 9.79模 型 組 400.00 10 治療前 8.32 ±1.71 5.64 ±1.76 134.35 ±18.33 3.71 ±0.85 116.17 ± 6.64治療后 — — — —柴 胡 龍 牡 湯 組 400.00 10 治療前 8.02 ±1.57 5.72 ±1.74 139.15 ±16.50 3.58 ±1.05 116.25 ± 4.78治療后 4.29 ±1.69 3.15 ±1.23 100.38 ±16.94 4.01 ±0.87 115.57 ± 3.56*

2.6 各組小鼠脾上清液中自然殺傷細(xì)胞活性、脾上清液中IFN-γ和IL-10含量比較

表6顯示，柴胡龍牡湯組小鼠脾上清液中自然殺傷細(xì)胞活性明顯高于模型組和順鉑化療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);柴胡龍牡湯組高于順鉑化療組和恩度聯(lián)合NP治療組的脾上清液中IFN-γ含量，模型組明顯更少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);柴胡龍牡湯組小鼠脾上清液IL-10含量明顯低于模型組、順鉑化療組和恩度聯(lián)合NP治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.7 各組小鼠的脾臟T淋巴細(xì)胞亞群的比較

表7顯示，柴胡龍牡湯組脾臟T淋巴細(xì)胞的CD4+、CD4+/CD8+比值和模型組、順鉑放射組、恩度聯(lián)合NP治療組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，CD8+差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

3 討論

原發(fā)性支氣管肺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率居各種惡性腫瘤之首，由于腫瘤的隱匿性和早期診斷方法的缺乏，導(dǎo)致大約2/3的患者在確診時(shí)已屬晚期［7］。目前晚期非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的治療 NCCN指南推薦以放化療聯(lián)合為主的模式，其中一線標(biāo)準(zhǔn)治療以4～6個(gè)周期含鉑雙聯(lián)方案化療為主 ，有效率僅20% ～40%，中位生存期8～10個(gè)月［9］，雖然可短時(shí)期內(nèi)控制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，改善患者癥狀，但大部分患者在3～4個(gè)月后出現(xiàn)病情的進(jìn)展與惡化。絕大多數(shù)抗腫瘤藥物缺乏理想的選擇性和靶細(xì)胞作用，因此在抑制腫瘤的同時(shí)，往往不同程度地影響機(jī)體正常組織細(xì)胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及重要臟器，影響患者生存質(zhì)量，使許多患者難以接受和堅(jiān)持化療?；熓遣荒苁中g(shù)患者和手術(shù)未能根治的患者的主要治療方法［4］，單純化療療效不令人滿意，2年以上生存率僅為10% ～20%［10］。以上治療方法失敗的原因在與局部治療的失控和(或)腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［11］。中醫(yī)藥在治療晚期肺癌中發(fā)揮了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，它能延長(zhǎng)患者生存期，改善生存狀況且能增效解毒。目前已有很多種中藥制劑應(yīng)用于臨床，如消積飲、長(zhǎng)必安膠囊、十全大補(bǔ)湯、健脾益肺化瘀方、益肺抗瘤飲、槲皮素等。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，它們都對(duì)小鼠的Lewis肺癌具有明顯的抑制作用，其主要機(jī)理為抑制腫瘤細(xì)胞周期的DNA合成，影響Lewis肺癌細(xì)胞的基因表達(dá)，從而達(dá)到抑制肺癌細(xì)胞的分裂與增殖，糾正免疫微循環(huán)紊亂;影響腫瘤細(xì)胞凋亡而起到抑制腫瘤作用;抑制Lewis肺癌毛細(xì)血管生成，降低血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的表達(dá)，促使樹(shù)突浸潤(rùn)成熟，微血管減少可導(dǎo)致腫瘤組織內(nèi)缺血缺氧引起腫瘤細(xì)胞凋亡，由此減少由血行擴(kuò)散而導(dǎo)致的腫瘤轉(zhuǎn)移等［12］。目前中醫(yī)認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生與氣機(jī)升降失常有密切關(guān)系，可通過(guò)調(diào)理肝、脾、腎來(lái)減輕惡性腫瘤患者的臨床癥狀，提高生質(zhì)量?！端貑?wèn)·至真要大論》指出，疾病的治療原則是“高者抑之，下者舉之”、“疏其氣血，令其條達(dá)，而致和平”，也就是調(diào)和陰陽(yáng)、平衡氣血。柴胡龍牡湯由小柴胡加龍骨牡蠣湯加減而成，具有理肝、化飲、調(diào)陰陽(yáng)、和榮衛(wèi)、助升降、和肝膽、鎮(zhèn)驚止悸作用，臨床多用于抑郁癥的治療，被認(rèn)為是治療郁癥、驚悸怔忡、失眠、癲狂等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主方之一。由于柴胡龍牡湯的調(diào)暢氣機(jī)作用，則陰陽(yáng)氣血調(diào)和，以達(dá)“陰陽(yáng)和則疾病自愈”的特殊作用，與腫瘤的部分機(jī)制相類似，因此有作者以此方治療肺癌患者取得了較好的療效［13］。

表6 各組小鼠自然殺傷細(xì)胞活性、脾上清液中IFN-γ含量、脾上清液中IL-10含量比較(±s)

表6 各組小鼠自然殺傷細(xì)胞活性、脾上清液中IFN-γ含量、脾上清液中IL-10含量比較(±s)

注:*P＜0.05，表示柴胡龍牡湯組小鼠脾上清液自然殺傷細(xì)胞活性、小鼠脾上清液中IFN-γ含量及小鼠脾上清液中IL-10含量與模型組、順鉑化療組、恩度聯(lián)合NP治療組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

組別 劑量(mg/d)樣本數(shù)(n)小鼠脾上清液自然殺傷細(xì)胞活性(%)小鼠脾上清液中IFN-γ含量(pg/ml)小鼠脾上清液中IL-10含量(pg/ml)0.02 10 14.68 ±2.05 50.71 ±10.09 148.51 ±29.41恩 度 聯(lián) 合 NP 對(duì) 照 組 15.00 10 13.23 ±1.99 57.63 ±11.87 133.54 ±18.77模 型 組 400.00 10 19.36 ±0.02 49.51 ± 6.59 153.28 ±33.08柴 胡 龍 牡 湯 組 400.00 10 52.45 ±0.16 65.87 ±17.86 117.31 ±11.62順鉑化療對(duì)照組*

表7 各組小鼠的脾臟T淋巴細(xì)胞亞群的比較(±s)

表7 各組小鼠的脾臟T淋巴細(xì)胞亞群的比較(±s)

注:*P＜0.05，表示柴胡龍牡湯組CD4+、CD4+/CD8+的比值模型組、順鉑放射組、恩度聯(lián)合NP治療組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

組別 劑量(mg/d)樣本數(shù)(n)CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+順 鉑 化 療 對(duì) 照 組0.02 10 13.21 ±1.81 16.71 ±1.59 0.88 ±0.24恩 度 聯(lián) 合 NP 對(duì) 照 組 15.00 10 15.18 ±1.87 16.62 ±1.03 0.93 ±0.17模 型 組 400.00 10 9.13 ±2.21 14.59 ±3.31 0.64 ±0.46柴 胡 龍 牡 湯 組 400.00 10 22.25 ±6.79* 15.52 ±4.45 1.41 ±0.36*

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用柴胡龍牡湯組在減輕Lewis肺癌瘤體的質(zhì)量、抑制腫瘤肺組織轉(zhuǎn)移、降低腫瘤細(xì)胞的增殖能力方面與模型組比較差異顯著，但與順鉑等化療藥物比較差異顯著，提示柴胡龍牡湯在抑制腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移方面不如化療藥物。這可能與中藥的多靶點(diǎn)多途徑而作用點(diǎn)不集中有關(guān)，也可能與實(shí)驗(yàn)周期短有關(guān)。而在提高脾臟的自然殺傷細(xì)胞活性和IFN-γ含量、降低脾臟中IL-10含量方面，與采用生理鹽水治療的模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，也高于于順鉑化療組和恩度聯(lián)合NP治療組。柴胡龍牡組T淋巴細(xì)胞的CD4+、CD4+/CD8+和模型組、順鉑放射組和恩度聯(lián)合NP對(duì)照組比較差異顯著。說(shuō)明柴胡龍牡湯對(duì)Lewis肺癌的抑制作用，可能不是直接針對(duì)癌細(xì)胞，而是通過(guò)調(diào)整免疫、扶助“正氣”并能夠避免化療帶來(lái)的損傷正常免疫細(xì)胞和引起炎癥反應(yīng)的副作用，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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