滑膜炎顆粒對(duì)Ⅱ型膠原關(guān)節(jié)炎模型的治療作用研究

孫麗華，張志偉，張華健，周艷華，崔海峰，于友華，王正品，孫明杰△

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100700;2.中藥注射劑新藥開(kāi)發(fā)技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，河北三河 065201;3.河北省中藥注射液工程技術(shù)研究中心，河北三河 065201;4.神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，石家莊 051430)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一個(gè)累及周?chē)P(guān)節(jié)為主的多系統(tǒng)炎癥性自身免疫病，滑膜的慢性炎癥性病變侵及下層的軟骨和骨，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)變形、功能障礙。由于RA的病因不明，目前尚無(wú)根治本病的藥物，因此尋找和發(fā)現(xiàn)有效、低毒治療RA的藥物一直成為研究的熱點(diǎn)。中醫(yī)藥有著悠久的歷史和長(zhǎng)期的臨床用藥經(jīng)驗(yàn)，在RA治療中發(fā)揮著重要作用。滑膜炎顆粒由夏枯草、女貞子、功勞葉、黃芪、防己、薏苡仁、土茯苓、絲瓜絡(luò)、澤蘭、丹參、當(dāng)歸、川牛膝、豨薟草組成，具有清熱利濕、活血通絡(luò)作用，臨床用于急、慢性滑膜炎及膝關(guān)節(jié)術(shù)后的治療。然而目前對(duì)RA滑膜損傷的治療作用尚缺乏系統(tǒng)研究。膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型(Collagen induced arthritis，CIA)是一種免疫性炎癥模型，其與RA的臨床表現(xiàn)相似，常用于RA治療藥物的篩選［1］。本文以CIA模型為研究對(duì)象，探討滑膜炎顆粒對(duì)RA滑膜損傷的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量(160±10)g，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號(hào)SCXK-(軍)2007-004)。實(shí)驗(yàn)在中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障環(huán)境中進(jìn)行(許可證號(hào) SYXK(京)2010-0032)，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.1.2 藥品與主要儀器 滑膜炎顆粒由神威藥業(yè)(張家口)有限公司提供;雷公藤多苷片(TGT)由黃石飛云制藥有限公司生產(chǎn)(批號(hào)20111201);醋酸潑尼松龍由上海信誼藥廠有限公司生產(chǎn)(批號(hào)120402);牛Ⅱ型膠原(批號(hào)120287)、不完全弗氏佐劑(批號(hào)120326)購(gòu)自美國(guó)Chondrex公司;T細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑盒為美國(guó)BD公司;YLS-7B足趾容積測(cè)量?jī)x由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站生產(chǎn);FASCAria TM流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 動(dòng)物購(gòu)進(jìn)后適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d制備CIA模型，成模后根據(jù)造模及給藥情況進(jìn)行隨機(jī)分組，分為8組，每組11～12只大鼠，分別為對(duì)照組(Ⅰ)、不完全弗氏佐劑組(Ⅱ)、模型組(Ⅲ)、雷公藤多苷組(Ⅳ)、醋酸潑尼松龍組(Ⅴ)、滑膜炎顆粒大劑量組 (Ⅵ)、中劑量組(Ⅶ)、小劑量組(Ⅷ)。

1.2.2 主要試劑配制 Ⅱ型膠原配置:取適量牛Ⅱ型膠原溶液逐滴加入等容積的不完全弗氏佐劑中，勻漿器分散使其充分乳化，以滴入水中不擴(kuò)散為標(biāo)準(zhǔn)，配成濃度為1 mg/mL的乳劑，以上操作均在冰浴中進(jìn)行。

1.2.3 CIA模型的制備 參照文獻(xiàn)［2］，?、蛐湍z原乳劑注射于大鼠尾根部皮下，0.2 ml/只。7 d后加強(qiáng)免疫1次，0.1 ml/只注射于大鼠尾根部皮下;對(duì)照組注射生理鹽水，佐劑組注射不完全弗氏佐劑。造模成功后，按足趾腫脹度調(diào)整各造模組動(dòng)物，剔除未成模大鼠。

1.2.4 給藥方法 加強(qiáng)免疫6 d后開(kāi)始給藥，對(duì)照組、不完全弗氏佐劑組及模型組給予等體積純水。雷公藤多苷片9.45 mg/kg，醋酸潑尼松龍2.70 mg/kg，滑膜炎顆粒分為大、中、小3個(gè)給藥劑量，分別為9.68 g生藥/kg、4.84 g生藥/kg、2.42 g生藥/kg。給藥體積1 mL/100 g，每天1次，連續(xù)灌胃給藥36 d，每周監(jiān)測(cè)體質(zhì)量1次。

1.2.5 足趾容積測(cè)定 致炎前在大鼠后肢踝關(guān)節(jié)上方0.5 cm處劃一水平標(biāo)志線(xiàn)，用足趾容積測(cè)量?jī)x測(cè)量其容積，左手握住大鼠前肢，右手捉住大鼠后膝關(guān)節(jié)處使其后腳伸直，以?xún)x器托手架做依托，緩慢放入測(cè)量杯內(nèi)，當(dāng)水平面與鼠足部測(cè)量標(biāo)線(xiàn)重疊時(shí)按下測(cè)量開(kāi)關(guān)。加強(qiáng)免疫后每3 d測(cè)1次足趾容積，計(jì)算關(guān)節(jié)腫脹度。腫脹度=(造模后左后足容積+造模后右后足容積)－(造模前左后足容積+造模前右后足容積)。

1.2.6 關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分 給藥開(kāi)始進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分，每3 d 1次。關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):前爪:關(guān)節(jié)的炎癥(無(wú)0分，有1分);后爪:腫脹(無(wú)0分，輕度1分，中度2分，重度3分);指掌關(guān)節(jié)變形(無(wú)0分，有1分)，前爪和后爪指(趾)紅腫(無(wú)0分，有 1 分);跖骨變形(無(wú) 0 分，有 1 分)［3，4］。

1.2.7 踝關(guān)節(jié)病理形態(tài)改變 末次給藥后24 h處死動(dòng)物，取踝關(guān)節(jié)固定于10%的福爾馬林溶液中，脫鈣后常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色觀察踝關(guān)節(jié)形態(tài)學(xué)改變。根據(jù)關(guān)節(jié)各部位病變輕重程度建立定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［5］:依次定量為1分(輕度或少量)、2分(中度或多量)、3分(重度或大量)，無(wú)病變組織為0分。累加各單項(xiàng)評(píng)分即為損傷總分，得分越高即表明損傷程度越嚴(yán)重，并對(duì)各單項(xiàng)評(píng)分及總分進(jìn)行組間比較。

1.2.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠T細(xì)胞亞群 按試劑盒說(shuō)明操作，末次給藥后24 h腹主動(dòng)脈取血處死大鼠，收集EDTA抗凝大鼠全血200 μL，分別加入APC標(biāo)記的CD3抗體、PE標(biāo)記的CD4抗體和FITC標(biāo)記的CD8抗體，室溫避光孵育30 min，加入2.0 mL裂解液輕輕振蕩，室溫孵育15 min，200 Xg，離心5 min棄上清，加入2 mL含1%胎牛血清的PBS重懸血細(xì)胞懸液，200 Xg，離心5 min棄上清，重懸細(xì)胞懸液于0.5 mL PBS中，上機(jī)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism 4.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 滑膜炎顆粒對(duì)CIA大鼠體質(zhì)量的影響

圖1顯示，造模后隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)，各組動(dòng)物體質(zhì)量均增加，但模型組及各給藥組體質(zhì)量增加較空白對(duì)照組緩慢，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。各給藥組體質(zhì)量高于模型組，但與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 給藥后各組大鼠體質(zhì)量變化

2.2 滑膜炎顆粒對(duì)CIA大鼠足趾腫脹度影響

測(cè)量造模前后大鼠足趾容積比較各組大鼠足腫脹情況，結(jié)果表明加強(qiáng)免疫后6 d，各造模組動(dòng)物足趾出現(xiàn)不同程度腫脹，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)，所有大鼠足腫脹程度均有不同程度減輕，各給藥組動(dòng)物足腫脹程度較模型組減輕更明顯。其中Ⅳ組TGT組給藥12 d時(shí)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);Ⅴ組醋酸潑尼松龍組于給藥6 d起，足趾腫脹度減輕明顯，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);Ⅶ組滑膜炎中劑量組給藥后15 d、18 d、24 d、27 d、30 d、33 d與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05，圖2)。

圖2 滑膜炎顆粒對(duì)各組大鼠足趾腫脹影響

2.3 滑膜炎顆粒對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)影響

關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分結(jié)果顯示，對(duì)照組、佐劑組大鼠關(guān)節(jié)無(wú)改變，各造模組動(dòng)物關(guān)節(jié)紅腫、變形，隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)各組關(guān)節(jié)紅腫情況逐漸減輕，其中Ⅳ組雷公藤多苷片組給藥12 d、21 d關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分低于模型組，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.05);給藥36 d關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分高于模型組，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ組關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分均低于模型組，其中Ⅴ組醋酸潑尼松龍組于給藥6 d開(kāi)始，關(guān)節(jié)指數(shù)評(píng)分與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);，Ⅵ組滑膜炎大劑量組于給藥12 d、21 d、24 d關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P ＜0.01);Ⅶ組于給藥12 d、21 d、24 d、30 d 與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，圖3)。

圖3 給藥后各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)變化

2.4 滑膜炎顆粒對(duì)CIA大鼠踝關(guān)節(jié)病理形態(tài)學(xué)變化的影響

圖4顯示，正常對(duì)照組、不完全佐劑組關(guān)節(jié)及滑膜結(jié)構(gòu)正常，關(guān)節(jié)軟骨表面光滑平整，無(wú)炎細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，無(wú)血管翳形成。模型組關(guān)節(jié)腔明顯變窄，TPT、潑尼松龍和滑膜炎各劑量組出現(xiàn)滑膜、軟骨、纖維組織及小血管增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但較模型組有明顯改善(圖4)。根據(jù)關(guān)節(jié)各部位病變輕重程度建立定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(如表1)，各給藥組病理?yè)p傷與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 滑膜炎顆粒對(duì)CIA大鼠T細(xì)胞亞群影響

表2顯示，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組大鼠外周血T細(xì)胞亞群的變化，結(jié)果顯示模型動(dòng)物和各給藥組CD3+T(TT)細(xì)胞總數(shù)在外周血T細(xì)胞所占的百分比與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組Th細(xì)胞在CD3+T細(xì)胞中所占百分比顯著高于正常對(duì)照組，Ⅲ、Ⅴ、Ⅷ組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.05);滑膜炎顆粒各給藥組Th細(xì)胞百分比均較模型組有所下降，但與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;各組大鼠Tc細(xì)胞在CD3+T細(xì)胞中所占比例顯著低于正常對(duì)照組，Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.05);各組大鼠Th/Tc的比值明顯高于對(duì)照組，Ⅲ、Ⅴ組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);滑膜炎顆粒各給藥組Th/Tc比值均較模型組有所下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 滑膜炎顆粒對(duì)大鼠關(guān)節(jié)病理形態(tài)變化評(píng)分

圖4

表2 給藥后各組大鼠T細(xì)胞亞群的變化

3 討論

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，因陽(yáng)氣受損、腠理空虛、衛(wèi)氣不固、風(fēng)寒濕邪乘虛侵襲肌膚，致氣血凝滯、經(jīng)絡(luò)痹阻，從而導(dǎo)致患部腫脹疼痛，關(guān)節(jié)僵硬變形。在RA中滑膜的持續(xù)性增生、軟骨和骨組織的破壞是其重要的病理學(xué)特征。

目前RA動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，主要采用佐劑性關(guān)節(jié)炎模型(AA)和CIA模型。模型大鼠關(guān)節(jié)病理觀察顯示，CIA大鼠滑膜增生、軟骨破壞、炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度較AA大鼠明顯，持續(xù)時(shí)間也較AA模型長(zhǎng)，與RA臨床特點(diǎn)更接近［1］。故本實(shí)驗(yàn)采用Ⅱ型膠原大鼠尾根部注射，制備CIA模型。造模后大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，較對(duì)照組體質(zhì)量明顯降低，加強(qiáng)免疫后6 d，大鼠出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫、活動(dòng)受限，隨著病程進(jìn)展，受累關(guān)節(jié)出現(xiàn)不同程度變形，提示CIA模型成功。糖皮質(zhì)激素在RA急性期能迅速減輕關(guān)節(jié)疼痛和腫脹癥狀。雷公藤多苷具有抗炎及免疫抑制作用，廣泛用于RA的治療［6］，故本實(shí)驗(yàn)選取醋酸潑尼松龍與雷公藤多苷片作為西藥和中藥陽(yáng)性對(duì)照藥物，二者對(duì)CIA模型呈現(xiàn)出較好的治療作用。然而隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)，雷公藤多苷片組關(guān)節(jié)變形改善較差，故給藥36 d時(shí)關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分高于模型組?；ぱ最w粒功效清熱利濕、活血通絡(luò)，用于治療急、慢性滑膜炎，其中夏枯草、薏苡仁、防己、澤蘭、黃芪促進(jìn)積液吸收;土茯苓、豨薟草、絲瓜絡(luò)改善關(guān)節(jié)活動(dòng)度;川牛膝、丹參、當(dāng)歸消腫止痛;女貞子、功勞葉強(qiáng)壯關(guān)節(jié)［7］。本實(shí)驗(yàn)滑膜炎顆粒各劑量組能夠改善足趾腫脹程度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分，高劑量組(9.68 g生藥/kg)、中劑量組(4.84 g生藥/kg)與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，小劑量組也呈現(xiàn)較好的治療趨勢(shì)。踝關(guān)節(jié)病理切片顯示，模型組關(guān)節(jié)腔明顯變窄，軟骨、纖維組織及小血管增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜炎顆粒各給藥組能夠不同程度改善上述癥狀，踝關(guān)節(jié)病理形態(tài)變化評(píng)分低于模型組，表明滑膜炎顆粒對(duì)RA滑膜損傷具有較好的治療作用，與整體足趾腫脹程度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)的檢測(cè)結(jié)果相一致。

T淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)中的主要調(diào)節(jié)及效應(yīng)細(xì)胞，根據(jù)其表面標(biāo)志不同成熟T細(xì)胞可分為2個(gè)亞類(lèi)，即CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞。CD4+T細(xì)胞按其功能可分為輔助性T細(xì)胞(TH)和遲發(fā)型超敏性T細(xì)胞(TDTH)，前者為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，后者為效應(yīng)性T細(xì)胞。CD8+T細(xì)胞也是不均一的細(xì)胞群，按其功能分為抑制性T細(xì)胞(TS)和殺傷性T細(xì)胞(TC)，前者為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，后者為效應(yīng)性T細(xì)胞。近年來(lái)，分泌白介素17的CD4+T細(xì)胞亞群(TH17細(xì)胞)被認(rèn)為與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病密切相關(guān)，RA患者體內(nèi)以CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞亞群異常增加為特征，異?；罨腃D3+CD4+T淋巴細(xì)胞通過(guò)釋放大量促炎性細(xì)胞因子加速病灶部位的組織損傷［8］。本研究各造模組大鼠Th細(xì)胞百分比、Th/Tc均高于空白對(duì)照組，Tc細(xì)胞百分比均低于對(duì)照組，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致?；ぱ最w粒各給藥組Th細(xì)胞百分比、Th/Tc均低于模型組，Tc細(xì)胞百分比均高于模型組，說(shuō)明滑膜炎顆粒對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)損傷治療作用與降低Th細(xì)胞百分比相關(guān)。而潑尼松龍組Th細(xì)胞百分比、Th/Tc與模型組大體相當(dāng)，說(shuō)明其治療RA作用與Th細(xì)胞可能不相關(guān)。

總之，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用CIA模型動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)滑膜炎顆?？诡?lèi)風(fēng)濕作用，并通過(guò)流式細(xì)胞儀深入探討其作用效應(yīng)與T細(xì)胞亞群的相關(guān)性，為臨床應(yīng)用滑膜炎顆粒治療RA滑膜損傷提供了實(shí)驗(yàn)參考，然而其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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