加味六味地黃湯對UUO大鼠腎組織TGF-β1及EMT的影響＊

黃仁發(fā)，梁群卿，吳金玉，向少偉，龍 韻，康 雷

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，南寧 530011;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，南寧 530023;3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院門診辦公室，北京 100700)

目前認為，腎小管上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化(Epithelial-mesenchymal transformation，EMT)是腎間質(zhì)纖維化(Renal interstitial fibrosis，RIF)形成最重要的病理過程［1］。我們的前期臨床研究表明，六味地黃湯及其怡腎湯(六味地黃湯加桂枝、荊芥、大黃)能改善5/6腎切除大鼠腎臟病理，減少CKD患者的蛋白尿，改善腎功能，降低血清纖維連接蛋白、IV型膠原纖維等致纖維因子，改善CKD患者的免疫功能，抑制微炎癥狀態(tài)，有較好的抗腎纖維化作用［2～6］。但加味六味地黃抗腎纖維化的信號機制尚未完全清楚。本研究中，我們探討該方對單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)大鼠腎組織轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β，TGF-β1)及EMT 的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

10～12周齡健康雄性清潔級 SD(Sprasue-Dawley)大鼠，體質(zhì)量(210±34)g共45只，購自上海斯萊克景達實驗動物有限公司(動物合格證號SCXK(湘)2009-0004)，在廣西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物學(xué)部飼養(yǎng)，在室溫18～25℃、相對濕度50% ～60%、人工12 h晝/夜循環(huán)照明環(huán)境中用全價營養(yǎng)、分籠飼養(yǎng)。每日定時清洗籠舍，大鼠能自由攝食及飲水。

1.2 主要儀器和試劑

BX-50生物光學(xué)顯微鏡、水平電泳槽、TGF-β1多克隆抗體(santa cruz，sc-146)、α-SMA多克隆抗體(santa cruz，sc-58670)、E-Cadherin 多克隆 抗 體(santa cruz，sc-31020)、SP 免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、蛋白提取試劑盒(上海申能博彩生物技術(shù)公司)、BCA蛋白定量試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)公司、PMSF(江蘇碧云天生物技術(shù)公司)、PDVF膜(蘇州廣惠科技有限公司)。

1.3 加味六味地黃湯組成及制備

加味六味地黃湯組成:熟地黃10 g，山茱萸10 g，干山藥 15 g，澤瀉 10 g，茯苓 12 g，丹皮 10 g，大黃10 g，桂枝 10 g，丹參 15 g，黃芪 30 g，以上藥物共132 g，均購自廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院藥劑科。先將藥材用相當于藥材5倍的自來水浸泡2 h，煮沸后再微火煎煮30 min，過濾后收集煎液，原藥渣加少量水煎煮得二煎液。兩煎液混合，于水浴恒溫器上濃縮至濃度為每毫升藥液含生藥1 g。

1.4 單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠模型的建立

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，10%的水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，然后將大鼠俯臥位固定于大鼠固定板上，鼠背部左肋下備皮，常規(guī)消毒，沿腋后線從左肋下向尾部方向剪開皮膚，鈍性分離皮下肌層和組織，暴露左腎，沿腎蒂向腎下極方向?qū)ふ逸斈蚬?，在輸尿管上段行雙線(4號絲線)結(jié)扎，兩結(jié)扎點間剪斷輸尿管，逐層縫合皮下組織和皮膚，假手術(shù)組除不結(jié)扎輸尿管外其他手術(shù)步驟均相同。

1.5 分組給藥

健康成年SD大鼠90只，按體質(zhì)量隨機分為假手術(shù)組(n=30)、模型組(n=30)、中藥組(n=30)，3組組內(nèi)再分為7 d、14 d、28 d 3個時間點，每個時間點處死10只大鼠，假手術(shù)組和模型組每日給予生理鹽水(2 ml/只/d)灌胃;中藥組在造模后按上法制備加味六味地黃湯藥液(2 ml/只/d)灌胃;留取各組大鼠血液及左腎組織檢測相關(guān)指標。

1.6 指標檢測

1.6.1 腎功能檢測 收集血液，自動生化儀檢測腎功能尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)水平。

1.6.2 腎臟病理檢測 取左側(cè)1/2腎臟置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中，將標本按順序脫水、石蠟包埋、切片、行HE染色和Masson染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察腎間質(zhì)改變并攝像。按以下方法進行評估［7］:首先計算30個高倍視野(×400)腎皮質(zhì)中發(fā)生損害(腎小管擴張、萎縮、管型、壞死或小管炎)的腎小管數(shù)目和總腎小管數(shù)，以損害的腎小管數(shù)占總腎小管數(shù)的百分比表示。腎間質(zhì)纖維化程度進行半定量評估，分值為0～4分，0分為正常;1分為腎間質(zhì)纖維化面積不超過視野25%;2分為25%～49%;3分為50%～75%;4分為超過75%。計算30個腎皮質(zhì)高倍視野(×400)，求和、取平均數(shù)，得該標本腎間質(zhì)纖維化分值。

1.6.2 免疫組織化學(xué)法檢測各組大鼠腎組織α-SMA、E-Cadherin蛋白的表達 切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶，0.01M枸櫞酸緩沖液煮沸修復(fù)抗原，羊血清工作液封閉，分別滴加α-SMA多克隆抗體(1∶150)、E-Cadherin多克隆抗體(1∶150)，37℃ 孵育 30 min，4℃ 過夜。DAB顯色5～20 min，顯微鏡下觀察大鼠腎組織蛋白表達的量及部位，腎小管上皮細胞胞漿有棕黃色顆粒為陽性，不著色者為陰性。每個標本隨機選取10個皮質(zhì)及外髓不重疊高倍(200×)視野計算細胞陽性率。細胞陽性率=陽性細胞數(shù)/視野所有細胞數(shù)×100%，取平均值作為每只實驗大鼠的檢測值，然后通過統(tǒng)計學(xué)方法進行半定量分析。

1.6.3 Western blot法檢測各組大鼠腎組織TGF-β1蛋白的表達 取保存的腎組織50～100 mg在冰上剪成碎片，加入蛋白裂解液提取組織總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。按Western blot步驟進行電泳、轉(zhuǎn)膜，進行 TGF-β1 多克隆抗體(1∶300)、β-actin多克隆抗體(1∶300)的免疫檢測，蛋白條帶用IPP圖像分析軟件檢測其OD值，用β-actin蛋白作為內(nèi)參照，通過計算比值(OD目的蛋白/ODβ-actin)即目的蛋白的表達量來分析TGF-β1蛋白相對表達水平。

2 結(jié)果

2.1 加味六味地黃湯對大鼠腎功能BUN和Scr水平的影響

表1顯示，假手術(shù)組BUN和Scr水平正常，而模型組大鼠第7天開始出現(xiàn)BUN和Scr水平增高，之后逐漸升高，至28 d達到高峰。與假手術(shù)組同時間點比較，模型組大鼠BUN和Scr水平增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與模型組相同時間點比較，中藥組大鼠BUN和Scr水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 加味六味地黃湯對大鼠腎臟病理的影響

圖1、2和表1顯示，假手術(shù)組大鼠腎小管間質(zhì)基本正常。而模型組大鼠第7天開始出現(xiàn)腎小管萎縮、間質(zhì)纖維化，之后病變逐漸加重，至28天腎小管萎縮、間質(zhì)纖維化達高峰。而經(jīng)加味六味地黃湯干預(yù)后，腎小管萎縮、間質(zhì)纖維化等病變明顯改善。半定量評分結(jié)果表明，與假手術(shù)組相同時間點比較，模型組大鼠計分明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與模型組相同時間點比較，中藥組大鼠腎小管間質(zhì)評分降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 加味六味地黃湯對大鼠腎功能BUN和Scr水平的影響(±s，mg/dl)

表1 加味六味地黃湯對大鼠腎功能BUN和Scr水平的影響(±s，mg/dl)

注:與假手術(shù)組比較:*P＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較:△P ＜0.05，△△P ＜0.01

組 別 例數(shù)Scr時間點BUN 10 7 d 14 d 28 d 7 d 14 d 28 d假 手 術(shù) 組 10 12.15± 4.24 11.96±3.98 12.07± 4.32 0.38±0.08 0.40±0.10 0.42±0.13模 型 組 10 42.56 ±10.64＊＊ 46.96 ±9.36＊＊ 48.67 ±10.25＊＊ 2.21 ±0.68＊＊ 2.76 ±0.36＊＊ 3.52 ±0.47＊＊中 藥 組 10 34.87± 8.72△ 38.21±6.63△ 39.31±10.86△ 1.60±0.45△ 2.10±0.58△ 2.83±0.69△

圖1 HE染色(×400)

圖2 Masson染色(×400)

表2 各組大鼠腎小管間質(zhì)半定量評分比較(±s)

表2 各組大鼠腎小管間質(zhì)半定量評分比較(±s)

注:與假手術(shù)組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較:△P＜0.05

組 別 例數(shù)7 d 14 d 28 d假手術(shù)組10 0.12±0.04 0.13±0.05 0.11±0.03模 型 組 10 1.87 ±0.68＊＊ 2.62 ±1.12＊＊ 4.12 ±1.64＊＊中 藥 組 10 1.28±0.52△ 1.95±0.68△ 3.31±1.84△

2.3 加味六味地黃湯對大鼠腎臟E-Cadherin、α-SMA蛋白的影響

假手術(shù)組大鼠腎小管可見較多的E-Cadherin陽性蛋白表達，極少量的α-SMA陽性蛋白表達;模型組大鼠第7天即可見到較多的α-SMA陽性蛋白表達，而E-Cadherin陽性蛋白表達減少，隨時間延長α-SMA陽性蛋白表達增多，E-Cadherin陽性蛋白表達下調(diào)，至第 28天 α-SMA蛋白達高峰，而 ECadherin陽性蛋白最少，與假手術(shù)組相同時間點α-SMA和E-Cadherin蛋白表達比較，模型組表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。經(jīng)加味六味地黃湯治療后，腎小管α-SMA陽性蛋白表達下調(diào)，E-Cadherin陽性蛋白上調(diào)，與模型組相同時間點比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

圖3 各組大鼠腎組織α-SMA蛋白表達(免疫組化×200)

表3 各組大鼠腎小管α-SMA蛋白陽性細胞數(shù)表達(±s)

表3 各組大鼠腎小管α-SMA蛋白陽性細胞數(shù)表達(±s)

注:與假手術(shù)組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較:△P＜0.05

組 別 例數(shù)7 d 14 d 28 d假手術(shù)組10 8.72±2.06 9.18± 1.96 8.95± 2.14模 型 組 10 17.26±6.24＊＊ 28.58±10.36＊＊ 38.71±13.25＊＊中 藥 組 10 11.47±4.82△ 19.67±8.74△ 31.35±7.96△

圖4 各組大鼠腎組織E-Cadherin蛋白表達(免疫組化×200)

表4 各組大鼠腎小管E-Cadherin蛋白陽性細胞數(shù)表達(±s)

表4 各組大鼠腎小管E-Cadherin蛋白陽性細胞數(shù)表達(±s)

注:與假手術(shù)組比較:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較:△P ＜0.05

組 別 例數(shù)7 d 14 d 28 d假手術(shù)組10 39.45±15.78 38.21±14.57 38.36±12.05模 型 組 10 30.17±14.22＊＊ 26.64±12.18＊＊ 21.35±12.56＊＊中 藥 組 10 36.21±10.45△ 32.39±13.66△ 28.47±10.81△

2.4 加味六味地黃湯對大鼠腎臟TGF-β1蛋白表達的影響

假手術(shù)組大鼠腎小管可見少量的 TGF-β1蛋白表達;模型組大鼠第7天即可見到較多的TGFβ蛋白表達，隨時間延長二者表達增多，至第28天達高峰，與假手術(shù)組相同時間點比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。經(jīng)加味六味地黃湯治療后，腎組織TGF-β1蛋白表達下調(diào)，與模型組相同時間點比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

圖5 各組大鼠腎組織TGF-β1蛋白表達(western blot)

3 討論

RIF是導(dǎo)致腎功能喪失最主要的病理生理過程之一。RIF形成分子機制復(fù)雜，目前認為腎小管上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化(Epithelial-mesenchymal transformation，EMT)是 RIF形成最重要的病理過程［1］。EMT形成的標志是腎小管上皮細胞失去其上皮細胞表型E-鈣黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(vimentin)，獲得MyoF表型如 α-平滑肌動蛋白(α-SMA)［1］，后者通過破壞的腎小管基底膜轉(zhuǎn)位至腎間質(zhì)，分泌III型膠原、IV型膠原等細胞外基質(zhì)增多，從而引起RIF［8］。近年來，已有大量的實驗研究證實，TGF-β1在RIF時EMT過程中起到重要的作用，被認為是最關(guān)鍵的致纖維化因子之一［8］。而抑制TGF-β1介導(dǎo)的EMT過程是減輕纖維化的重要手段。

表5 各組大鼠腎組織TGF-β1蛋白的表達(－x ± s，OD 目的/OD 內(nèi)參)

中醫(yī)理論雖無“腎纖維化”一詞，但各種CKD最終可因久病傷正而導(dǎo)致正虛邪實、濁邪上逆，最終發(fā)展至水腫、癃閉、關(guān)格。在RIF的發(fā)生發(fā)展過程中，其本虛標實的病機特點已為大多數(shù)醫(yī)家所認可，正不勝邪，“虛、瘀、濕、毒”是重要的四大病理因素，其中“虛”是RIF的根本，腎虛在RIF的整個病程中起至關(guān)重要的作用［10］。而“濕”、“瘀”是 RIF的病理基礎(chǔ)，“毒”則是 RIF發(fā)展后期不可忽視的因素［11］。瘀血濁毒貫穿于纖維化整個病變過程中，是引起腎纖維化的主要因素［10］。因此，我們將中醫(yī)藥抑制RIF、延緩腎衰竭進程的切入點應(yīng)放在補脾腎、祛濕、活血化瘀及排毒上。

六味地黃丸出自宋·錢乙《小兒藥證直訣》，結(jié)合RIF時“虛、瘀、濕、毒”的四大病理因素及單味藥研究結(jié)果，我們在六味地黃湯基礎(chǔ)上加桂枝、大黃、黃芪、丹參，取桂枝通陽利水濕，大黃通便以排毒，黃芪益氣健脾利水，丹參活血化瘀，取名加味六味地黃湯，全方共奏補益脾腎、利水活血、排毒的功能。本實驗主要探討六味地黃湯加味是否通過阻斷TGF-β1的活化、抑制EMT過程，從而發(fā)揮延緩RIF的發(fā)生發(fā)展的作用。

我們的結(jié)果表明，加味六味地黃湯可改善腎小管間質(zhì)病變及腎功能，提示具有較好的腎保護作用。進一步研究顯示，隨著RIF的程度加重，UUO大鼠腎小管 TGF-β1和 α-SMA表達增多，而 E-Cadherin蛋白表達減少，證實RIF過程中存在TGF-β1介導(dǎo)的EMT過程。而加味六味地黃湯可以下調(diào)腎小管TGF-β1和α-SMA的表達，上調(diào)E-Cadherin蛋白的表達，提示加味六味地黃湯抗RIF的機制可能與抑制TGF-β1介導(dǎo)的EMT過程有關(guān)，但加味六味地黃湯抗RIF的其他機制有待進一步研究。

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