MMP－2在葡萄胎組織中的表達及意義

常雅麗，趙志茹，雷 敏，李曉紅，王大維

(河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院，河北石家莊050051)

葡萄胎亦稱水泡狀胎塊，指妊娠后滋養(yǎng)細胞增生，絨毛間質(zhì)水腫，成水泡狀相連成串，形如葡萄而得名。葡萄胎雖為良性病變，但具有一定的惡變傾向，早期發(fā)現(xiàn)其惡變的治療效果較好，還會降低對單一化療產(chǎn)生耐藥而行聯(lián)合化療的可能性，甚至對惡變可能性大的患者實施預防性化療以減少惡變。侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的一大特征。其涉及的因素眾多，其中細胞外基質(zhì)和基底膜的降解是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的重要步驟，這與細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的參與密不可分。MMP－2又稱Ⅳ型膠原酶或明膠酶A，是腫瘤發(fā)展過程中最為重要的相關(guān)蛋白酶之一。本研究通過測定MMP－2在葡萄胎組織中的表達，探討其在葡萄胎發(fā)生發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移中作用，以確定其是否能成為預測葡萄胎惡變的重要指標。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集2005年11月—2012年7月于本院就診并行清宮術(shù)后病理診斷為葡萄胎的30例患者首次清宮組織，并收集正常早孕(6～8周)無其他疾病、要求終止妊娠的20例患者絨毛組織。將組織分為正常絨毛組(20例)、葡萄胎組(24例)、侵蝕性葡萄胎組(侵葡組3例)，在30例葡萄胎患者中經(jīng)隨訪確診為侵蝕性葡萄胎3例，惡變率占10%;失訪者3例，1例為低危，2例為高危。葡萄胎組中，2例曾患過葡萄胎，1例再次懷孕后自然流產(chǎn)且病理診斷為絨毛水腫。

1.2 方法 所收集組織用4%中性甲醛浸泡，清水沖洗，100%，90%，75%的梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)石蠟切片，厚度為0.5 μm。石蠟切片脫蠟。清水沖洗3遍，放入95℃以上的修復液中進行熱水浴修復10 min(葡萄胎組織修復10 min，絨毛組織修復8 min)。放置室溫待修復液溫度降為37℃以下，清水沖洗3次。放入3%H2O2溶液37℃敷育20 min。蒸餾水沖洗后，PBS浸泡5 min。滴加鼠抗人MMP－2單克隆抗體(北京中杉生物技術(shù)有限公司)一抗，濃度為1∶200，4℃過夜。水清洗3遍，滴加鼠抗羊二抗(北京中杉生物技術(shù)有限公司)37℃溫育40 min;清水沖洗3遍，滴加新鮮配制DAB試劑，在光學顯微鏡下觀察染色，適時終止染色。蘇木精復染，分化反藍，脫水、透明、封片，在光鏡下行結(jié)果判斷。每個切片隨機挑選5個視野，用HMIAS－2000圖像處理系統(tǒng)統(tǒng)計灰度值，取平均灰度值作為切片結(jié)果，灰度值越低說明蛋白表達越多。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，各組MMP－2表達強度比較采用兩個獨立樣本的t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 光鏡下形態(tài)觀察 ①正常絨毛的鏡下形態(tài):絨毛中的合體滋養(yǎng)層細胞與細胞滋養(yǎng)層細胞排列整齊，異型細胞較少。見圖1。②葡萄胎的鏡下形態(tài):絨毛間質(zhì)水腫形成較大的中央水池，見圖2。滋養(yǎng)細胞增生，主要為合體滋養(yǎng)層細胞增生且具有一定的異型性，內(nèi)層細胞滋養(yǎng)層細胞排列較為整齊，兩種細胞經(jīng)常混合在一起，見圖3。③鏡下MMP－2的表達定位:MMP－2主要表達于合體滋養(yǎng)層細胞以及細胞滋養(yǎng)層細胞的胞漿，少量表達于合體滋養(yǎng)層細胞以及細胞滋養(yǎng)層細胞的細胞膜。

圖1 MMP－2在正常組織中的表達(200×)

圖2 MMP－2在葡萄胎組織中的表達(200×)

圖3 MMP－2在侵蝕性葡萄胎組織中的表達(200×)

2.2 MMP－2測定結(jié)果 MMP－2在侵葡組、葡萄胎組以及正常絨毛組的灰密度值依次為 71.87 ±16.43，93.38 ±11.45，105.33 ±15.12，組間比較均有顯著性差異(P 均 ＜0.05)。

3 討 論

葡萄胎是婦產(chǎn)科常見的良性病變，是一種來源于胎盤絨毛滋養(yǎng)細胞的疾病，絨毛基質(zhì)微血管消失，成水泡狀相連成串，它包括完全性葡萄胎和部分性葡萄胎。其中完全性葡萄胎較為常見，雖然清宮治療后大部分葡萄胎能夠自然治愈，但仍有20%左右完全性葡萄胎發(fā)展呈侵蝕性葡萄胎及絨癌，其中絨癌惡性程度最高，預后最差，易產(chǎn)生耐藥和治療失敗，對全身多臟器功能造成不同程度的傷害，甚至導致死亡。絨癌約50%自葡萄胎發(fā)展而來并需要進行化學治療，因此葡萄胎乃是妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤的主要來源，將來是否惡變是治療葡萄胎中醫(yī)患雙方最關(guān)心的問題。

許多研究表明，基因表達的改變與良性病細胞的生長、惡變及轉(zhuǎn)移有關(guān)［1］，與腫瘤細胞相似。但與腫瘤細胞不同的是，在正常妊娠中，絨毛的浸潤在時間上和空間上均具有局限性，在時間上限于孕早期，而空間上限于種植部位的子宮內(nèi)膜、子宮肌層的淺1/3(足月時下降到10%以下)以及相關(guān)的螺旋動脈［2］。許多研究已表明，絨毛的浸潤過程受到各種因素的精細調(diào)節(jié)，如激素、細胞因子、生長因子和細胞外基質(zhì)糖蛋白以及各種轉(zhuǎn)錄因子等。在此過程中各個因子相互促進或相互抑制才使胚胎正常發(fā)育，母體不被破壞。

細胞外基質(zhì)的降解是腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的重要途徑，基底膜是細胞外基質(zhì)成分之一，它是腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的屏障，基底膜侵襲與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移性和預后有關(guān)。腫瘤細胞通過分解基底膜的Ⅳ型膠原層的黏連蛋白和纖維連接蛋白直接侵襲鄰近正常組織或穿過血管到達靶器官，使轉(zhuǎn)移部位惡性增生，促進惡變及轉(zhuǎn)移的發(fā)生。MMPs是一個鋅離子依賴的蛋白酶家族，其廣泛分布于人體內(nèi)，在生理過程中維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，而在病理過程中，MMPs參與了腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移復發(fā)、慢性炎癥、組織纖維化等［1－3］。MMPs能降解細胞外基質(zhì)及基底膜的Ⅳ型膠原，腫瘤細胞利用MMPs的基質(zhì)降解能力遷移到其他部位，在腫瘤與間質(zhì)的交界處，MMPs往往呈高表達。而MMP－2又稱Ⅳ型膠原酶或明膠酶A，是鋅離子依賴的蛋白酶家族中最重要的酶之一，它可以降解細胞外基質(zhì)和基底膜，從而破壞局部的組織結(jié)構(gòu)以促進腫瘤細胞的侵襲。Morgan 等［4］對滋養(yǎng)細胞帶(ED27、ED31、ED77)進行檢測發(fā)現(xiàn)，MMP－2和MMP－9滋養(yǎng)細胞帶中都有表達，且均有侵襲能力。

MMP－2不但可降解基底膜糖蛋白及細胞外基質(zhì)(ECM)成分，而且在腫瘤新生血管的形成過程中也起著非常重要的作用。MMP－2可使基質(zhì)崩潰，從而為新生血管開辟了道路。而目前較多的研究也提示MMP－2誘導腫瘤血管生成也許是其促進癌細胞生長與轉(zhuǎn)移的機制之一，由此可見MMP－2是惡性侵襲性腫瘤的一個敏感指標。

滋養(yǎng)細胞之所以具有侵襲性是因為自身能分泌MMPs，其蛋白表達強度和滋養(yǎng)層細胞的浸潤能力相一致。在胚胎植入前細胞滋養(yǎng)層(CTB)主要分泌MMP－2，這就說明在此時期MMP－2起著重要作用。李楠等［5］研究報道在早期純化的CTB中明膠酶活性顯著，其侵襲能力與TIMP－2和MMP－2抗體的劑量有關(guān)，提示滋養(yǎng)層的侵襲能力可能和MMP－2的活性有關(guān)。李淑娟等［6］通過對妊娠6～8周的絨毛進行研究，發(fā)現(xiàn)在此階段，MMP－2的表達較高，這說明在此階段MMP－2是滋養(yǎng)細胞侵襲的關(guān)鍵水解酶。

本實驗中，MMP－2主要表達在增生細胞與滋養(yǎng)細胞的胞漿中，且在侵蝕性葡萄胎、葡萄胎、正常早孕絨毛中的表達呈下降趨勢，MMP－2在正常早孕絨毛的組織中雖有一定量的表達，但較侵蝕性葡萄胎與葡萄胎的表達低，正常絨毛的陽性表達大部分在外層細胞滋養(yǎng)層的胞漿中。因為在孕早期細胞滋養(yǎng)層細胞具有一定的侵蝕能力，而正常絨毛組織中又含有拮抗MMP－2的因子，包括金屬蛋白酶組織抑制物(TIMP－1～4)、尿激酶原激活物(uPA)和纖溶酶原激活物抑制物1(PAI－1)［7］，它們與MMP－2相互作用形成一個動態(tài)平衡，以調(diào)節(jié)絨毛的侵襲能力，使正常絨毛侵襲母體時在空間及時間上均有局限性。過氧化物酶體增殖物激活型受體γ(PPARγ)激活后可能是通過抑制細胞滋養(yǎng)細胞MMP－2的表達，從而影響滋養(yǎng)細胞的浸潤能力，一旦細胞內(nèi)的平衡狀態(tài)被打破將會導致侵襲能力不足，從而造成胚胎不能著床或者侵襲能力過強導致發(fā)生滋養(yǎng)細胞疾?。?］。研究顯示滋養(yǎng)細胞侵襲力與MMP－2、MMP－9相關(guān)，與MMP－2關(guān)系更為密切［8］，妊娠8周內(nèi)及絨毛膜癌中MMP－2起主要調(diào)節(jié)作用，推測基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物TIMP－2分泌減少與腫瘤發(fā)生可能相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，MMP－2在侵蝕性葡萄胎、葡萄胎、正常早孕絨毛中的表達呈逐漸遞減的趨勢，說明MMP－2與葡萄胎的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，其有可能成為預測葡萄胎惡變的一個新指標。

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