衰變加速因子在神經(jīng)病理性疼痛中的作用

朱海娟，王金保

(解放軍白求恩國際和平醫(yī)院，河北石家莊050082)

前期研究證實(shí)神經(jīng)病理性疼痛(CNPP)大鼠脊髓背角發(fā)生補(bǔ)體異?；罨?，并且證實(shí)此處活化的補(bǔ)體蛋白在模型動(dòng)物痛覺過敏的形成和發(fā)展中發(fā)揮重要作用［1］。那么，衰變加速因子(DAF，CD55)作為重要的補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白，它在NPP的發(fā)病過程中是否發(fā)揮作用呢?本研究制作2種NPP大鼠模型(CCI、SNI)，采用熱刺激和機(jī)械刺激兩種手段評(píng)估模型的可靠性后，于建立模型第7天，采用Western－blot和免疫組織化學(xué)染色兩種技術(shù)測(cè)定大鼠脊髓中的DAF蛋白表達(dá)變化，旨在為NPP大鼠脊髓背角補(bǔ)體激活尋找“激發(fā)點(diǎn)”。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 成年健康SD大鼠，雄性，體質(zhì)量200～250 g，河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。每4只飼養(yǎng)于一籠中，籠底鋪有鋸末，室溫(20±2)℃，嚴(yán)格12 h明暗交替光照，給予充足的水源和飼料。適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)均在白天進(jìn)行，大鼠的使用和喂養(yǎng)嚴(yán)格遵照河北醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)和動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)所規(guī)定的有關(guān)條款。60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組)、CCI組(B組)及SNI組(C組)3組，每組20只。按照分組進(jìn)行處理后，分別在術(shù)前(t0)、術(shù)后1 d(t1)、術(shù)后3 d(t2)和術(shù)后7 d(t3)進(jìn)行痛閾值測(cè)定，于術(shù)后7 d處死大鼠取L4—6段脊髓背角，測(cè)定CD55蛋白含量。

1.2 主要儀器和試劑 儀器:RTY－1型熱痛刺激儀，第四軍醫(yī)大學(xué)生理教研室研制;BME－403型Von frey機(jī)械刺激儀，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所提供;BB16uv型CO2恒溫培養(yǎng)箱，德國Heraeus公司生產(chǎn);恒溫?fù)u床，重慶醫(yī)用器材廠生產(chǎn);Gel Doc2000凝膠成像分析系統(tǒng)，美國Bio－Rad公司生產(chǎn)。試劑:兔抗大鼠CD55多克隆抗體(CD55(H－319)，批號(hào):sc－9156)，美國Santa Cruz公司生產(chǎn);辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)親和純化二抗，購自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.3 CCI、SNI模型的制作 參考文獻(xiàn)［2］制作CCI和SNI模型。CCI模型:大鼠俯臥位捆綁，從后肢上部切開皮膚，分離肌肉，暴露坐骨神經(jīng)主干，使用羊腸線環(huán)繞坐骨神經(jīng)，單結(jié)固定，環(huán)繞的羊腸線應(yīng)能夠在坐骨神經(jīng)主干上滑動(dòng)。SNI模型:于大鼠后肢上緣切開皮膚，分離肌肉，暴露坐骨神經(jīng)主干及其下的分支—脛神經(jīng)、腓總神經(jīng)和腓腸神經(jīng)，結(jié)扎并剪斷脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)，保留細(xì)小的腓腸神經(jīng)，應(yīng)避免任何損傷。

1.4 行為學(xué)測(cè)定

1.4.1 熱痛閾測(cè)定 用RYT－1型熱痛刺激儀測(cè)大鼠熱縮足潛伏期(PWTL)。按 Hargeaves等［3］方法，于 8:00—12:00測(cè)定，先將大鼠在熱刺激儀的玻璃操作臺(tái)上適應(yīng)5 min，調(diào)節(jié)光強(qiáng)度，單次照射時(shí)間不超過30 s，以免造成熱輻射損傷，每肢照射3次，取其平均值。為避免或減少1次刺激對(duì)隨后刺激效應(yīng)造成的影響，同一部位刺激的間隔時(shí)間為5 min。

1.4.2 機(jī)械痛閾測(cè)定 參照Dixon［4］的方法:將大鼠置于升高的金屬網(wǎng)上，并蓋以透明的有機(jī)玻璃罩，適應(yīng)20 min，用不同壓力的纖維絲(從小到大)垂直刺激其足底2，3跖趾間皮膚敏感處，逐漸加壓使之成為S形持續(xù)6～8 s，觀察是否出現(xiàn)縮足反應(yīng)，大鼠在刺激時(shí)間內(nèi)或在移開von frey纖維時(shí)立即出現(xiàn)快速的縮足反應(yīng)，記為陽性反應(yīng)，而身體活動(dòng)所引起的縮足反應(yīng)不記作陽性反應(yīng)。每次間隔5 s，連續(xù)10次，誘發(fā)4～6次縮足反應(yīng)作為50%反應(yīng)率，其壓力值即為閾值。

1.5 免疫組織化學(xué)染色 采用SP法對(duì)大鼠脊髓標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色。腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后，經(jīng)左心室灌注200 mL生理鹽水和300 mL 4%多聚甲醛溶液，充分固定后，縱向剖開椎管，取脊髓L4—6階段組織，固定24 h，經(jīng)脫水、透明、浸蠟包埋后，切片機(jī)連續(xù)切片厚度為4 μm。石蠟切片經(jīng)二甲苯透明，常規(guī)梯度乙醇脫蠟，浸入0.01 mol/L，pH 6.0枸櫞酸鹽溶液中，加熱至98℃后進(jìn)行抗原修復(fù)，30 min后冷卻至室溫，3%H2O2去離子水室溫孵育20 min，正常兔血清封閉液室溫孵育20 min。滴加一抗(兔抗大鼠CD55多克隆抗體)4℃孵育過夜，同時(shí)用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。PBS液充分洗滌后，加入二抗(辣根酶標(biāo)記兔抗山羊IgG)37℃孵育30 min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，透明、封片。在OLYPUS顯微鏡下觀察，胞膜和胞質(zhì)中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。

1.6 Western－blot檢測(cè) 于術(shù)后7 d處死大鼠取L4—6段脊髓背角，采用Western－blot技術(shù)測(cè)定CD55蛋白含量。取每樣40 μg蛋白樣品按常規(guī)方法完成8%(w/v)SDS－PAGE電泳，將含有目的蛋白和內(nèi)標(biāo)actin的凝膠切割，并經(jīng)半干法電轉(zhuǎn)移至聚偏(二)氟乙烯(PVDF)膜上。印跡膜片用5%脫脂奶粉封閉1 h，大膜片加入抗大鼠CD55單克隆抗體，小膜片加入羊抗actin抗體，4℃過夜。用 Tris/0.05%吐溫 －20(TBST)洗膜(5 min×3)，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗(山羊抗鼠IgG)，37℃孵育1 h，TBST充分洗膜(5 min×3)，TBS洗膜10 min。最后印跡膜片與強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑ECL溫浴1 min，X線膠片曝光30～60 s，經(jīng)顯影和定影顯示特異的蛋白信號(hào)。大膜片經(jīng)膜再生液再生(37℃孵育30 min)后孵育鼠抗NR2B抗體，程序同前。信號(hào)條帶掃描后，用Quantity one 4.5.0圖像分析軟件進(jìn)行定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠痛閾值情況 與術(shù)前相比，術(shù)后1 d 3組大鼠PWTL和PWMT都有所降低，但B組、C組較A組更明顯(P＜0.05)。術(shù)后3，7 d CCI組SNI組大鼠痛閾值持續(xù)降低，而A組大鼠痛閾值逐漸恢復(fù)到術(shù)前水平。見表1。

2.2 脊髓背角免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 A組脊髓背角陽性細(xì)胞明顯多于B組和C組，B組和C組相比無顯著性差異。見圖1～3。

表1 各組大鼠痛閾比較(±s)

表1 各組大鼠痛閾比較(±s)

注:①與 t0相比，P ＜0.05;②與 A 組相比，P ＜0.05。

組別 n PWT/s t0 t1 t2 t 3 PWM/g t0 t1 t2 t 3 A 組 20 17.3 ±2.5 13.7 ±1.7① 16.6 ±2.3 16.8 ±2.2 14.2 ±1.9 9.5 ±3.1①13.8 ±2.8 13.7 ±2.5 B 組 20 17.5 ±1.9 12.8 ±3.2① 11.6 ±2.1①② 11.9 ±3.0①② 14.8 ±3.2 7.6 ±1.9① 8.8 ±2.5①② 8.2 ±1.4①②C 組 20 17.7 ±2.9 14.0 ±2.2① 12.8 ±1.8①② 13.4 ±3.5①② 13.9 ±2.0 7.8 ±1.5① 7.4 ±2.2①② 7.8 ±1.7①②

2.3 3組Western－blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果 采用Western－blot技術(shù)檢測(cè)了3組大鼠脊髓背角CD55的表達(dá)情況。用Quantity one 4.5.0圖像分析軟件分析，β－actin條帶的積光分密度(IOD)一致，反映了總蛋白上樣量一致，B組、C組大鼠脊髓背角CD55表達(dá)量較A組顯著降低。見圖4。

3 討 論

衰變加速因子是一種補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白，可制止補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)，保護(hù)自身細(xì)胞免受傷害。近來研究表明，DAF通過表達(dá)的改變，逃避機(jī)體免疫監(jiān)視，在腫瘤形成中發(fā)揮重要作用［5－6］。那么，在NPP形成過程中脊髓背角發(fā)生異常的補(bǔ)體活化，許多補(bǔ)體蛋白表達(dá)發(fā)生改變，DAF的表達(dá)是否發(fā)生變化?它的表達(dá)改變?cè)贜PP的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮什么樣的作用呢?

圖1 A組大鼠脊髓背角CD55陽性細(xì)胞表達(dá)情況

圖2 B組大鼠脊髓背角CD55陽性細(xì)胞表達(dá)情況

圖3 C組大鼠脊髓背角CD55陽性細(xì)胞表達(dá)情況

圖4 不同處理組大鼠脊髓背角CD55蛋白的表達(dá)情況

本研究建立了2種NPP模型，采用測(cè)定大鼠痛閾值可靠技術(shù)－冷刺激方法和機(jī)械刺激方法評(píng)估動(dòng)物模型的穩(wěn)定性后，于術(shù)后第7天處死大鼠，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)和免疫印跡技術(shù)2種手段對(duì)模型大鼠脊髓中的CD55進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，2種不同外周神經(jīng)損傷模型脊髓中CD55在建模后表達(dá)發(fā)生了不同程度的降低，與假手術(shù)組比較有顯著性差異。這個(gè)結(jié)果與筆者前期研究NPP時(shí)脊髓背角發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)是一致的［1］。那么，CD55是如何在NPP的形成中發(fā)揮作用的呢?外周神經(jīng)損傷時(shí)，脊髓背角膠質(zhì)細(xì)胞活化，表達(dá)補(bǔ)體蛋白量增加，進(jìn)而觸發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)［7］。正常情況下，由于細(xì)胞膜上表達(dá)的CD55分子可干擾C3轉(zhuǎn)化酶和C5轉(zhuǎn)化酶，以致不能形成膜攻擊復(fù)合，補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)被阻斷，保護(hù)自身細(xì)胞免受補(bǔ)體的活化和攻擊。當(dāng)CD55缺乏或表達(dá)下調(diào)時(shí)，補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)得以實(shí)現(xiàn)，膜攻擊復(fù)合物大量形成。此處的神經(jīng)元不斷遭受補(bǔ)體蛋白的攻擊，內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而將傷害性信號(hào)上傳中樞，經(jīng)過中樞的信息分析和整合，表現(xiàn)為痛覺過敏和異常疼痛。因此，可以推測(cè)，NPP模型大鼠脊髓中CD55的表達(dá)下降可能是此處發(fā)生補(bǔ)體異?；罨脑颍辽偈怯|發(fā)因素之一。

關(guān)于CD55在NPP中的研究目前還比較少，本研究只是為探索NPP發(fā)病機(jī)制提供一個(gè)思路。相信隨著研究的深入，NPP必將為人類所攻克。

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