母胎界面內(nèi)脂素、MMP－2、MMP－9的表達及其在妊娠期高血壓疾病發(fā)病中的意義

馮 靜，霍 琰，李紅艷，李季濱

(河北省人民醫(yī)院，河北石家莊050051)

子癇前期是妊娠期特發(fā)性疾病，以妊娠20周后出現(xiàn)高血壓、水腫、蛋白尿為主要臨床特征，可伴有全身多臟器功能損傷。該病病因不明，除終止妊娠外，臨床缺乏有效的治療方法，嚴重威脅母兒生命。母胎界面是胎盤與母體直接接觸的唯一部位，包括胎盤、胎盤附著處的底蛻膜及胎盤侵襲的子宮肌層。母胎界面蛻膜細胞、胎盤滋養(yǎng)細胞的生物學功能的改變，有可能導致了病理妊娠的發(fā)生。近年來“胎盤淺著床”理論逐漸被許多學者認為是子癇前期發(fā)病的根本原因，理論認為滋養(yǎng)細胞對子宮螺旋動脈侵蝕不足致使胎盤植入過淺，血流灌注不足，引起系統(tǒng)性的血管內(nèi)皮損傷，從而導致子癇前期臨床癥狀出現(xiàn)［1］，胎盤娩出后臨床癥狀逐漸消失。因此母胎界面成為研究子癇前期發(fā)病的焦點。近期研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織分泌的內(nèi)脂素(visfatin)可結(jié)合并激活胰島素受體，模擬胰島素的生物功能參與糖脂代謝;內(nèi)脂素能促進血管平滑肌細胞成熟，參與血管生成、炎癥反應、細胞分化及凋亡過程，與動脈粥樣硬化及血管內(nèi)皮損傷關系十分密切［2］。胚胎植入受很多因素的調(diào)節(jié)，包括子宮內(nèi)膜細胞外基質(zhì)降解和滋養(yǎng)層細胞對內(nèi)膜的侵入。胚胎的滋養(yǎng)層細胞侵入子宮，將胚胎黏附于子宮內(nèi)膜上，侵入血管內(nèi)皮使母體血管重建，從而滿足胎盤的血流供應［2］。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是參與子宮內(nèi)膜細胞外基質(zhì)降解的關鍵酶，主要由滋養(yǎng)細胞分泌，可溶解細胞外基質(zhì)，克服浸潤過程中的3個生理屏障(基底膜、蛻膜外間質(zhì)、子宮動脈腔面細胞衣)，最終蛻膜動脈內(nèi)皮被血管滋養(yǎng)細胞取代，母體的血液流向胎盤，使高阻力低容量的血管轉(zhuǎn)化為高容量低阻力的血管，因此MMPs在胚胎著床與血管重建過程中發(fā)揮重要作用。研究母胎界面的內(nèi)脂素、MMPs與子癇前期的關系是本課題研究的重點。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選擇2012年1月—2013年5月在本院并行剖宮產(chǎn)結(jié)束妊娠的子癇前期患者40例，年齡24～43(28．7±3．2)歲，孕周 32 ～40(34．7 ± 1．6)周，均符合《婦產(chǎn)科學》［3］中的妊娠期高血壓疾病診斷及分類標準。分為輕度子癇前期組20例，重度子癇前期組20例，排除有糖尿病、原發(fā)性高血壓和心、肝、腎病史者，感染、胎膜早破者。另選同期住院的正常孕婦40例作為對照組。3組均為單胎妊娠，年齡、孕周、體質(zhì)量指數(shù)、基礎血壓比較差異無統(tǒng)計學意義，見表1。

表1 3組臨床特征比較(±s)

表1 3組臨床特征比較(±s)

組別 n 年齡/歲 孕周/周 體質(zhì)量指數(shù)/(kg/m2對照組)40 25．4 ±3．2 38．4 ±1．2 25．2 ±1．3子癇前期輕度組 20 27．2 ±3．4 37．1 ±2．2 26．5 ±1．6子癇前期重度組20 28．3 ±4．5 34．4 ±2．4 27．1 ±1．2

1.2 方法

1.2.1 標本采集 胎盤娩出后立即剪取胎盤中央母體面約1．0 cm×1．0 cm×1．0 cm的胎盤組織，避開鈣化灶和機化灶，所有組織取材后立即用生理鹽水漂洗掉血液，放于10%甲醛液中固定，石蠟包埋，切片機連續(xù)切片。

1.2.2 檢測方法 采用免疫組化(S－P)法檢測內(nèi)脂素、MMP－2、MMP－9的表達(兔抗人單克隆抗體來自北京博奧森公司)。石蠟切片常規(guī)脫蠟，切片抗原熱修復，3%H2O2水孵育10 min，PBS液沖洗，分別滴加內(nèi)脂素、MMP－2、MMP－9一抗，37℃孵育30 min，PBS液沖洗，滴加二抗，室溫孵育30 min，PBS液沖洗，使用DAB溶液顯色，自來水充分沖洗，蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，脫水，透明，中性樹脂封片。

1.2.3 圖像采集與分析 采用(日本Olympus)顯微鏡進行圖片采集，每個研究對象隨機選一張切片，高倍鏡下(×400)隨機選擇5個視野。胞膜、胞漿、胞核內(nèi)有棕黃色沉淀，高于背景染色，鏡下結(jié)構(gòu)清晰為陽性細胞。每一個視野數(shù)100個蛻膜上皮細胞或滋養(yǎng)細胞，算出陽性細胞百分比。＜10%為0分，10% ～45%為1分，46% ～70%為2分，＞70%為3分;同時判定細胞染色強度:不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。根據(jù)2項評分之和，將內(nèi)脂素、MMP－2、MMP－9結(jié)果分為4級:0分為陰性(－)，2分為弱陽性(+)，3～4分為陽性，5～6分為強陽性。采用Image－proplus5．0軟件分析系統(tǒng)測定圖片積累光密度值，取平均值，并對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17．0統(tǒng)計軟件進行分析，各組間比較用均數(shù)±標準差(±s)，采用方差分析、t檢驗。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 內(nèi)脂素、MMP－2、MMP－9在胎盤中表達的定量分析對照組內(nèi)脂素在滋養(yǎng)細胞、蛻膜上皮組織、間質(zhì)及血管中均有表達。子癇前期組內(nèi)脂素主要在絨毛滋養(yǎng)細胞的包膜、胞漿中呈陽性表達。對照組MMP－2、MMP－9在滋養(yǎng)層細胞的胞漿及胞膜上呈陽性表達，MMP－2、MMP－9在子癇前期組胎盤組織中滋養(yǎng)細胞著色較淺，與對照組比，內(nèi)脂素在子癇前期輕度組的光密度值增加(P＜0．05)，在子癇前期重度組增加的則更明顯(P＜0．01)。MMP－2、MMP－9在子癇前期輕度組的光密度值降低(P＜0．05)，在子癇前期重度組的光密度值降低的更為明顯(P＜0．01)，經(jīng)單因素方差分析，各組的免疫組化光密度值差異均有統(tǒng)計學意義。見表2。

表2 3組胎盤中內(nèi)脂素、MMP－2、MMP－9的表達水平(±s)

表2 3組胎盤中內(nèi)脂素、MMP－2、MMP－9的表達水平(±s)

注:①與對照組比較，P＜0．05;②與對照組比較，P＜0．01;③與子癇前期輕度組比較，P＜0．05。

組別 n 內(nèi)脂素MMP－2 MMP－9對照組40 0．35 ±0．05 0．21 ±0．02 0．19 ±0．01子癇前期輕度組 20 0．43±0．01① 0．16±0．02① 0．15±0．01①子癇前期重度組 20 0．52 ±0．01②③ 0．13 ±0．02②③ 0．13 ±0．01②③

2.2 內(nèi)脂素、MMP－2、MMP－9在胎盤中的表達及相關性對照組及子癇前期組胎盤組織中內(nèi)脂素、MMP－2、MMP－9的表達經(jīng) Spearman相關性分析顯示，內(nèi)脂素與 MMP－2、MMP－9之間存在負相關性，相關系數(shù)r分別為－0．521 0(P＜0.001)、－0．463 1(P＜0．001)。MMP－2與 MMP－9之間存在著正相關性，其相關系數(shù)r為0．381 2(P＜0．001)。

3 討 論

子癇前期是妊娠期的特發(fā)性疾病，嚴重危及母嬰健康，是孕產(chǎn)婦和圍生兒死亡的主要原因，其病因目前尚不清楚，有諸多學說如胎盤淺著床、血管內(nèi)皮細胞受損、免疫、遺傳、胰島素抵抗、營養(yǎng)缺乏等。

目前研究發(fā)現(xiàn)脂肪組織是人體最大的內(nèi)分泌器官，脂肪細胞因子可分泌多種生物活性物質(zhì)，形成代謝－神經(jīng)內(nèi)分泌－免疫網(wǎng)絡，應對各種代謝問題。內(nèi)脂素是近年研究較多的脂肪細胞因子，其主要在內(nèi)臟脂肪組織中表達，以3種形式存在:與煙堿胺轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶抑制劑結(jié)合，與煙堿單核苷酸結(jié)合或游離存在。內(nèi)脂素具有類胰島素活性，參與糖脂代謝，促進脂肪的形成與分泌，其在血漿中的含量與內(nèi)臟脂肪的多少呈正相關，肥胖與高血壓病、高血脂癥常同時并存［4］。內(nèi)脂素可作用于血管，促進動脈粥樣硬化。前B細胞集落促進因子可通過調(diào)節(jié)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴蛋白脫乙?；窼ir2的活性，促進血管平滑肌細胞分化成熟。敲除內(nèi)脂素基因能增加血管平滑肌細胞的凋亡，降低其收縮能力，為高血壓是氧化還原反應改變血管結(jié)構(gòu)的分子機制提供了新線索。

內(nèi)脂素的主要生理功能有:①調(diào)節(jié)糖脂代謝。內(nèi)脂素能結(jié)合并激活胰島素受體，發(fā)揮類似胰島素樣的降糖作用［5］，內(nèi)脂素與胰島素受體結(jié)合的位點與胰島素與胰島素受體結(jié)合的位點不同。內(nèi)脂素與胰島素受體結(jié)合后激活胰島素的傳導通路，加強肌肉、脂肪組織對葡萄糖的轉(zhuǎn)運，抑制肝糖釋放。在血糖調(diào)節(jié)上內(nèi)脂素也起重要作用，如果內(nèi)脂素的生物合成或信號傳遞發(fā)生異?？蓪е录膊“l(fā)生。②促進血管平滑肌細胞成熟，調(diào)節(jié)血管的氧化應激狀態(tài)，改變高血壓時的血管重構(gòu)［6］。③參與炎癥反應和免疫調(diào)節(jié)過程。內(nèi)脂素作為一個內(nèi)源性炎癥因子，與免疫細胞的物質(zhì)代謝、信號傳導、組織修復炎癥抑制、獲得性免疫激活、凋亡等生理過程的關系非常密切［7］。④參與血管形成和動脈粥樣硬化。內(nèi)脂素能誘導血管生成，參與血管生成紊亂。內(nèi)脂素通過激活磷脂酰肌醇3激酶、蛋白激酶B、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶等途徑，調(diào)節(jié)人臍靜脈內(nèi)皮細胞的金屬蛋白酶的基因表達。⑤內(nèi)脂素基因還可能是一種新的缺氧誘導基因，子癇前期機體處于缺氧狀態(tài)，胎盤中內(nèi)脂素mRNA表達增加，參與子癇前期發(fā)生、發(fā)展［8］。

MMPs是1994年在小鼠胚胎發(fā)育中的破骨細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，其作用底物為層黏連蛋白、Ⅳ型膠原、Ⅴ型膠原、Ⅰ型膠原、Ⅴ型明膠及彈性蛋白。應用MMPs的特異性抗體及金屬蛋白酶抑制劑能完全抑制細胞滋養(yǎng)細胞的侵蝕性。Ⅳ型膠原是內(nèi)皮細胞基底膜所特有，由此可見MMPs在滋養(yǎng)細胞的侵蝕及血管重鑄中發(fā)揮著重要的作用。絨毛外滋養(yǎng)細胞侵入母體分為3個階段:第一階段是細胞和細胞外基質(zhì)的黏附，第二階段是著床部位細胞外基質(zhì)極性的降解，第三階段是穿透細胞外基質(zhì)。其中第二階段需要能夠降解細胞外基質(zhì)的酶類，而細胞外基質(zhì)的降解必須要有MMPs的參與。滋養(yǎng)細胞侵襲的限速步驟是MMPs系統(tǒng)對細胞外基質(zhì)的降解，因此MMPs在滋養(yǎng)細胞的侵蝕和胎盤血管床重鑄過程中發(fā)揮著重大作用。并且MMPs與其拮抗劑TIMP－1共同嚴格調(diào)控著滋養(yǎng)細胞侵蝕的過程，使滋養(yǎng)細胞的侵蝕不會過深或過淺。正常孕婦胎盤上螺旋動脈壁的厚度隨妊娠進展而逐漸變薄，且滋養(yǎng)細胞浸潤螺旋動脈壁，而子癇前期孕婦螺旋動脈壁較厚，且螺旋小動脈上幾乎不含滋養(yǎng)細胞，大部分滋養(yǎng)細胞距螺旋動脈有相當?shù)木嚯x，這樣螺旋動脈的生理重鑄不能完成，最終導致胎盤缺氧、灌注不足。妊娠期高血壓疾病患者胎盤中MMP－2、MMP－9的低表達使滋養(yǎng)細胞對子宮內(nèi)膜的侵蝕變表淺，以及螺旋小動脈的侵蝕受阻，導致胎盤淺著床、胎盤缺氧和缺血的特征性病理改變，最終導致子癇前期的發(fā)生［9］。

本研究通過免疫組化法檢測發(fā)現(xiàn)內(nèi)脂素在正常足月妊娠組胎盤組織中的免疫組化光密度值較高，說明內(nèi)脂素是母胎界面的一個重要細胞因子，調(diào)控著正常妊娠過程。輕度子癇前期患者的胎盤組織中內(nèi)脂素的免疫組化光密度值較對照組增加(P＜0．05)，重度子癇前期患者的胎盤組織中內(nèi)脂素的免疫組化光密度值較對照組增加更明顯(P＜0．01)，說明子癇前期的發(fā)生可能與內(nèi)脂素表達的異常增加有關。

許多胎盤激素和細胞因子對滋養(yǎng)細胞浸潤的調(diào)節(jié)都是通過控制MMP的分泌而實現(xiàn)的，所以MMP在滋養(yǎng)細胞浸潤過程中起重要作用。MMP－2、MMP－9在對照組胎盤組織中表達水平較高，但在子癇前期組MMP－2、MMP－9在胎盤組織中表達水平相對較低。MMP－2、MMP－9的表達水平隨子癇前期的嚴重程度增加而降低。因此推測，某些因素抑制了MMP－2、MMP－9蛋白酶的基因表達，從而使其相對應的滋養(yǎng)細胞的侵襲能力有所降低，從而導致了子癇前期的發(fā)病。

子癇前期患者存在明顯的脂質(zhì)代謝紊亂、胰島素抵抗、動脈粥樣硬化和內(nèi)皮細胞功能障礙及內(nèi)皮依賴性血管舒張反應異常。動脈粥樣硬化是多種因素共同作用的結(jié)果，目前其發(fā)病機制尚不清楚，學者多支持損傷－反應學說，認為導致動脈粥樣硬化的各種危險因素最終都會損傷動脈內(nèi)膜，而粥樣斑塊的形成是對內(nèi)膜損傷反應的結(jié)果。在粥樣斑塊形成過程中，巨噬細胞具有非常重要的作用。在高血脂癥、高血糖等條件下，巨噬細胞能分泌大量氧化代謝產(chǎn)物及生長調(diào)節(jié)因子，刺激成纖維細胞、平滑肌細胞的遷移和增生，從而形成動脈粥樣硬化。目前研究發(fā)現(xiàn)巨噬細胞能分泌內(nèi)脂素，內(nèi)脂素可通過抑制半胱氨酸蛋白酶Caspase－8和Caspase－3的活性，而抑制各種炎癥反應誘導的中性粒細胞凋亡，內(nèi)脂素水平可能決定心血管系統(tǒng)的炎癥狀態(tài)，從而可能導致動脈粥樣硬化的發(fā)生［1］。脂肪組織生長期間需要具備補充新生血管的能力，研究表明在體內(nèi)脂肪組織增長的過程中，內(nèi)脂素能促進脂肪細胞數(shù)量增加及組織形成，此作用是通過對血管產(chǎn)生影響而起作用的［1］。動脈粥樣硬化病變區(qū)斑塊擴大和易破的原因之一是進行性的血管發(fā)生，而且血管發(fā)生是斑塊破裂和血栓形成等并發(fā)癥的顯著危險因素。脂肪細胞因子是血管發(fā)生和動脈粥樣硬化之間聯(lián)系的紐帶，內(nèi)脂素在冠心病患者粥樣硬化斑塊破裂時表達水平增高。由此推測內(nèi)脂素在以異常新生毛細血管形成為基礎的動脈粥樣硬化的過程中發(fā)揮了一定作用。MMPs是參與動脈粥樣硬化的關鍵酶［8］。而滋養(yǎng)層細胞的自分泌和子宮的旁分泌因子內(nèi)脂素可調(diào)節(jié)MMPs的活性，因此母胎界面之間細胞因子的動態(tài)平衡對于重建基質(zhì)和控制侵入是很關鍵的。

通過對內(nèi)脂素、MMP－2、MMP－9之間在正常及子癇前期胎盤組織中表達的相關性進行研究，發(fā)現(xiàn)內(nèi)脂素與MMP－2、MMP－9之間呈負相關。說明胎盤組織滋養(yǎng)細胞中內(nèi)脂素的表達增加可能抑制了MMP－2、MMP－9的表達，內(nèi)脂素通過調(diào)節(jié)人臍靜脈內(nèi)皮細胞分泌MMP－2和MMP－9。同時研究發(fā)現(xiàn)在胎盤組織中MMP－2與MMP－9之間的表達呈正相關，說明MMP－2和MMP－9共同參與了胎盤滋養(yǎng)細胞的侵襲過程。同時MMP－2與MMP－9是參與動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生、發(fā)展和破裂的關鍵酶，故內(nèi)脂素與MMPs在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關鍵作用。內(nèi)脂素的異常增加會引起MMPs的反應性減少，從而造成絨毛淺著床和血管痙攣，導致胎盤灌注減少、缺氧，繼發(fā)胎盤血管內(nèi)皮損害，血漿成分沉積、脂質(zhì)蓄積于血管壁出現(xiàn)急性動脈粥樣硬化，血管管腔進一步縮窄，胎盤灌注進一步下降，胎盤缺血和代謝障礙使胎盤源性毒性因子的釋放增加，損傷血管內(nèi)皮細胞，引起血管痙攣性收縮，血壓升高，導致子癇前期的發(fā)病。提示內(nèi)脂素、MMPs與子癇前期的發(fā)病關系密切。

本研究表明內(nèi)脂素、MMP－2、MMP－9是妊娠期胎盤組織中的重要因子，參與了正常妊娠及子癇前期的發(fā)病過程，內(nèi)脂素、MMPs MMP－2、MMP－9表達水平與子癇前期的嚴重程度有一定的相關性。聯(lián)合檢測內(nèi)脂素、MMP－2、MMP－9，對子癇前期的臨床診斷、治療及預后有重要意義。

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