青蒿素對(duì)糖尿病大鼠腎臟保護(hù)作用機(jī)制研究

張麗坤，周鳳嬌，蘇彥君，張建勇，安志霞

(河北省石家莊市第二醫(yī)院，河北石家莊050051)

大量研究表明，糖尿病發(fā)病率在全球迅速上升，使糖尿病腎病發(fā)病率逐年增加，目前在發(fā)達(dá)國(guó)家，糖尿病腎病已成為引起終末期腎衰竭(ESRD)的首要原因。在糖尿病腎病的發(fā)病及病情進(jìn)展中，腎組織內(nèi)的腎素－血管緊張素系統(tǒng)(RAS)起重要作用，血糖高時(shí)可激活腎組織內(nèi)的RAS，引起腎組織內(nèi)血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)水平上升，AngⅡ通過(guò)與其受體AT1R發(fā)生結(jié)合，導(dǎo)致腎組織表達(dá)金屬蛋白酶－2組織抑制物(TIMP－2)與基質(zhì)金屬蛋白酶－2(MMP－2)的比例失調(diào)，刺激細(xì)胞外基質(zhì)降解減少，細(xì)胞外基質(zhì)堆積［1－3］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)糖尿病大鼠腎小球內(nèi)TIMP－2和MMP－2的表達(dá)以及青蒿素對(duì)其表達(dá)作用的觀察，來(lái)探討青蒿素對(duì)腎臟的保護(hù)機(jī)制，從而為臨床提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1 糖尿病模型大鼠 36只雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，實(shí)驗(yàn)所用大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(A組)、糖尿病非治療組(B組)及糖尿病青蒿素治療組(C組)，每組12只大鼠。B組和C組利用大鼠腹腔單劑量注射STZ(購(gòu)自Sigma公司)65 mg/kg制備糖尿病大鼠模型，A組只腹腔注射等量檸檬酸緩沖液，72 h后采尾靜脈血，使用達(dá)優(yōu)血糖儀(廣州達(dá)優(yōu)醫(yī)療設(shè)備有限公司生產(chǎn))測(cè)血糖，血糖≥16．7 mmol/L確定為糖尿病大鼠。

1.2 動(dòng)物給藥 自模型成功當(dāng)天起，C組大鼠腹腔注射青蒿素(購(gòu)自成都偉輝生物科技有限公司)300 g/(kg·d)溶于二甲基亞砜(DMSO)中，A組與B組分別給予腹腔注射等劑量DMSO。所有實(shí)驗(yàn)大鼠不使用胰島素及其他降糖藥物，可以自由進(jìn)食、飲水。實(shí)驗(yàn)第3周和第6周時(shí)，各組大鼠分別取6只宰殺。

1.3 標(biāo)本收集 宰殺大鼠前1 d收集24 h尿液，混合均勻后予以計(jì)量，然后取樣6 mL，－20℃冰箱保存，備測(cè)尿肌酐和24 h尿蛋白排泄率(UAER)。稱大鼠體質(zhì)量，然后取血5 mL，測(cè)定尿素氮、血糖及血肌酐。留取大鼠雙側(cè)腎臟，予以稱質(zhì)量，取部分右腎組織放于10%甲醛溶液浸泡、固定，以備PAS、HE及免疫組化染色檢查。

1.4 生化指標(biāo)檢測(cè) 用放免法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠尿白蛋白含量。用日產(chǎn)奧林巴斯AU400自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)所有生化指標(biāo)，計(jì)算肌酐清除率(Ccr)，其結(jié)果需用大鼠體質(zhì)量予以校正。

1.5 免疫組化染色 應(yīng)用SP方法。石蠟切片厚度4μm。陰性對(duì)照組用1%BSA代替一抗，檢測(cè)Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白(FN)、TIMP－2和MMP－2的表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血糖、腎質(zhì)量、體質(zhì)量及腎質(zhì)量/體質(zhì)量比較B組大鼠的體質(zhì)量均明顯低于A組，并且呈進(jìn)行性下降趨勢(shì)，腎質(zhì)量/體質(zhì)量、腎質(zhì)量都逐步上升。C組大鼠體質(zhì)量都高于B組，腎質(zhì)量/體質(zhì)量、腎質(zhì)量都低于B組。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、腎質(zhì)量、腎質(zhì)量/體質(zhì)量及血糖比較(±s)

表1 各組大鼠體質(zhì)量、腎質(zhì)量、腎質(zhì)量/體質(zhì)量及血糖比較(±s)

注:①與A組比較，P＜0．05;②與 A組比較，P＜0．01;③與 B組比較，P ＜0．05。

組別 n 時(shí)間 體質(zhì)量/g 腎質(zhì)量/g 腎質(zhì)量/體質(zhì)量/103血糖/(mmol/L)A組 6 3周6周259．10±6．49 359．00±5．01 0．76±0．04 0．71±0．08 2．38±0．03 2．71±0．04 7．99±0．82 8．20±0．86 B組 6 3周6周204．98±4．78①179．74±15．02②0．90±0．02①1．30±0．21①6．17±0．04①9．32±0．07②22．79±2．21①23．52±2．32①C組 6 3周6周239．21±5．72①218．58±6．65①③0．81±0．04③0．77±0．02③3．31±0．08③6．01±0．06①③22．53±1．98①24．12±1．80①

2.2 各組大鼠UAER以及腎功能比較 B組大鼠血UAER、Ccr及尿素氮比A組高。C組大鼠上述數(shù)值都明顯低于同期B組。見(jiàn)表2。

2.3 各組大鼠腎小球表達(dá)FN、TIMP－2、Ⅳ型膠原蛋白及MMP－2情況比較 相同時(shí)間比較發(fā)現(xiàn)，在對(duì)照組可見(jiàn)MMP－2蛋白主要在腎小球基底膜及系膜表達(dá)，在第3周和第6周時(shí)，其表達(dá)未見(jiàn)明顯變化;B組大鼠MMP－2蛋白在腎小球的表達(dá)顯著降低;C組大鼠MMP－2蛋白的表達(dá)與B組比較呈顯著上調(diào)趨勢(shì)。正常情況下，腎小球基底膜和系膜表達(dá)Ⅳ型膠原蛋白、TIMP－2和FN量較少，第6周與第3周比較，未見(jiàn)顯著改變;B組大鼠上述指標(biāo)與同期A組相比均逐漸增加;C組大鼠與B組大鼠比較，上述指標(biāo)都顯著下調(diào)。見(jiàn)表3。

表2 各組大鼠生化指標(biāo)及UAER比較(±s)

表2 各組大鼠生化指標(biāo)及UAER比較(±s)

注:①與A組比較，P＜0．01;②與 A組比較，P＜0．01;③與 B組比較，P ＜0．05。

組別 n 時(shí)間 尿素氮/(mmol/L)血肌酐/(μmol/L)Ccr/(mL/(min·kg))UAER/(μg/24h)A組 6 3周6周6．79±0．29 6．98±0．32 46．95±0．07 50．04±0．09 4．31±0．42 3．79±0．50 3．32±0．41 3．19±0．39 B組 6 3周6周11．63±0．45①14．43±0．30①49．76±2．12 62．19±1．98②4．83±0．09②6．31±0．07②6．12±0．68②34．01±0．50①C組 6 3周6周7．31±0．43②③8．81±0．82②③48．99±1．25 52．51±1．42③4．01±0．04③4．56±0．08②③4．09±0．81②③20．36±0．63②③

表3 各組大鼠腎小球表達(dá)MMP－2、TIMP－2、FN及Ⅳ型膠原蛋白情況(±s)

表3 各組大鼠腎小球表達(dá)MMP－2、TIMP－2、FN及Ⅳ型膠原蛋白情況(±s)

注:①與A組比較，P＜0．01;②與 A組比較，P＜0．05;③與 B組比較，P ＜0．05。

組別 n 時(shí)間 MMP－2 TIMP－2 FN Ⅳ型膠原A組 6 3周6周33．76±2．98 35．21±3．19 13．42±4．01 15．01±3．12 15．09±3．67 18．70±3．98 16．87±4．31 19．20±3．91 B組 6 3周6周20．30±3．89①9．39±3．76①21．76±3．75①46．21±3．05①22．40±3．84②49．90±4．71①24．81±4．21②60．21±1．31①C組 6 3周6周24．71±1．97③21．34±2．78②③14．76±3．32②③30．20±4．14①③17．02±4．32③36．41±4．69②③21．41±2．95②③38．19±1．36②③

2.4 實(shí)驗(yàn)大鼠腎臟病理變化 光鏡學(xué)表明:A組大鼠腎小球毛細(xì)血管襻薄，小管未見(jiàn)明顯病理變化;B組大鼠腎小球基底膜增厚，面積增大，并且系膜區(qū)增寬，病變呈進(jìn)展性，腎小管病變表現(xiàn)不顯著，并且沒(méi)發(fā)現(xiàn)腎小球硬化;C組大鼠腎小球病理變化較糖尿病非治療組顯著減輕，但比A組重。

3 討 論

糖尿病是世界上多數(shù)國(guó)家慢性腎衰竭的主要原因，其發(fā)病機(jī)制與多種因素有關(guān)，如代謝紊亂、血流動(dòng)力學(xué)異常、氧化應(yīng)激、遺傳等。近年來(lái)通過(guò)各種干預(yù)措施減少細(xì)胞外基質(zhì)堆積，成為糖尿病腎病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一［4－6］。

MMPs/TIMPs與糖尿病腎病的關(guān)系密切，該系統(tǒng)的失衡是導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)積聚、糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。糖尿病時(shí)高血糖的終末效應(yīng)是使MMPs表達(dá)下調(diào)，活性降低，TIMPs表達(dá)上調(diào)，減少細(xì)胞外基質(zhì)降解，從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)積聚。細(xì)胞基質(zhì)積聚引起的進(jìn)行性腎小球硬化與間質(zhì)纖維化是糖尿病腎病發(fā)展至終末期腎衰竭的主要病理表現(xiàn)［2－4］。

MMPs是一種鋅依賴的蛋白酶，活化的MMPs可被其所對(duì)應(yīng)的TIMPs按照1∶1的比例所抑制。MMP－2作為MMPs中的重要成分，主要降解Ⅳ型膠原、FN及層黏連蛋白。

本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠腎小球MMP－2表達(dá)減少，TIMP－2表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞外基質(zhì)大量堆積。而青蒿素治療組大鼠腎小球表達(dá)MMP－2明顯增加，其顯著抑制TIMP－2表達(dá)，顯著下調(diào)FN及Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)，明顯減輕腎小球細(xì)胞外基質(zhì)堆積，改善腎功能，降低尿白蛋白排泄，改善腎皮質(zhì)損傷。由于糖尿病組與治療組大鼠血糖比較無(wú)顯著性差異，提示青蒿素的腎臟保護(hù)作用與代謝因素?zé)o關(guān)。

［1］楊敬華，周巧玲，王衍慧，等．高糖對(duì)人類腎小球系膜細(xì)胞PKC及MMPs/TIMPs的影響［J］．中南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2009，34(5):425－431

［2］Hohenadel D，van der Woude FJ．Gene expression in diabetic nephropathy［J］．Curr Diab Rep，2004，4(6):462 －469

［3］Ji L，Yin XX，Wu ZM，et al．Ginkgo biloba extract prevents glucoseinduced accumulation of ECM in rat mesangial cells［J］．Phytother Res，2009，23(4):477 －485

［4］Urushihara M，Kagami S，Kuhara T，et al．Glomerular distribution and gelatinolytic activity of matrix metalloproteinases in human glomerulonephritis［J］．Nephrol Dial transplant，2002，17(7):1189 －1196

［5］Thrailkill KM，Bunn RC，F(xiàn)owlkes JL．Matrix metalloproteinases:their potential role in the pathogenesis of diabetic nephropathy［J］．Endocrine，2009，35(1):1 －10

［6］Wei S，Xie Z，F(xiàn)ilenova E，et al．Drosophila TIMPis a potent inhibitor of MMPs and TACE:similarities in structure and function to TIMP －3［J］．Biochemistry，2003，42(42):12200 －12207