慢性軟組織損害性疼痛外周不同組織中TNF-α表達的研究

董宏然，李啟芳，楊彬奎，吳華山，王全美

（1.南京總醫(yī)院湯山分院骨科，江蘇 南京 211131；2.上海第九人民醫(yī)院疼痛科，上海200011）

臨床上腰臀部軟組織損害和腰椎間盤突出癥都可以引起類似的腰腿麻痛等癥狀，但其發(fā)病機制不同，腰椎間盤突出引起的疼痛除了傳統(tǒng)的神經(jīng)機械壓迫外，還包括炎癥機制和免疫機制，而軟組織損害性疼痛的病灶部位是筋膜、肌肉、韌帶、關(guān)節(jié)囊等周圍軟組織，其病理基礎(chǔ)是軟組織損害引起的無菌性炎癥病變[1]，但無菌性炎癥的本質(zhì)尚不清楚。近年來，細胞因子在慢性疼痛中作用越來越受到重視。內(nèi)源性腫瘤壞死因子（TNF-α）是一種重要的致炎因子，它不僅在作為免疫系統(tǒng)的重要因子參與機體的免疫反應(yīng)，還在病理情況下由外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生[2]，在慢性疼痛的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。本研究以慢性軟組織損害性腰腿痛和腰椎間盤突出癥手術(shù)病人為研究對象，分別切取外周組織中三個不同部位的軟組織標(biāo)本，檢測其TNF-α的表達，以探討軟組織損害性疼痛可能的作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2010-01-2013-12我院行手術(shù)治療的腰臀部軟組織損害性疼痛患者18例為實驗組，男16例，女2例，平均年齡39.2歲，臨床表現(xiàn)為腰痛、臀部疼痛及下肢麻痛等癥狀；以手術(shù)治療的腰椎間盤突出癥患者16例為對照組，男5例，女11例，平均年齡51.1歲，臨床主要表現(xiàn)為腰腿痛、下肢平均麻木、行走困難等，其中腰4-5椎間盤突出5例、腰5骶1椎間盤突出5例、腰4-5腰5骶1椎間盤突出5例、腰3-骶1椎間盤突出1例。所有病例術(shù)前均常規(guī)行腰椎X線、CT及MRI檢查及相關(guān)血生化檢查，診斷明確。在手術(shù)中分別切取兩組病人脊柱后關(guān)節(jié)骨表面（部位1）、肌肉（部位2）、腰部深筋膜（部位3）軟組織標(biāo)本，-80℃深低溫冰箱保存。全部患者在術(shù)前均簽署知情同意書。

1.2 實驗材料和實驗儀器

RDHumanSubstanceP（SP）Elisa測定試劑盒，Lot：201401，Exp：201406。LabsystemsFinnpipette 100μl單道移液器，Thermo50μl8道移液器。HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司），華東電子DG5033A酶標(biāo)儀（南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司）。

1.3 操作步驟

1.3.1 本前處理：取樣本40μl待測。

1.3.2 測定過程：嚴(yán)格按照試劑盒的說明進行操作（1）測定前將試劑盒放置室溫40min，所有試劑在使用前都輕輕搖勻；（2）標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：取5個離心管分別標(biāo)記為S1、S2、S3、S4、S5，然后用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液把1280ng/L的標(biāo)準(zhǔn)品原液稀釋成40、80、160、320、640ng/L的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液；（3）加樣：分別設(shè)定空白孔（空白對照孔不加樣本、生物素標(biāo)記的抗-SP抗體及鏈霉親和素-HRP，其余各步操作相同）、待測樣品孔、標(biāo)準(zhǔn)孔。待測樣品孔加入樣本40μl，然后各加入抗-SP抗體10μl，鏈酶親和素-HRP50μl，標(biāo)準(zhǔn)品孔加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μl，鏈霉親和素-HRP50μl（標(biāo)準(zhǔn)品中已事先整合好生物素抗體，故不加）；加樣時將樣本加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。蓋上封板膜后，37℃溫育60min；（4）配液：濃縮洗滌液與新鮮的醫(yī)用雙蒸水1∶30倍稀釋，混勻后室溫放置待用；（5）洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s后棄去，如此重復(fù)5次，在吸水紙上將酶標(biāo)板拍干；（6）顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，然后37℃避光反應(yīng)10min，（7）終止：每孔加終止劑50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立即轉(zhuǎn)黃）；（8）測定：在華東電子DG5033A酶標(biāo)儀上，450nm處測定OD；（9）計算：根據(jù)制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣本含量；（P＞0.05）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用Graphpad統(tǒng)計分析軟件，兩組以上采用單因素方差分析對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，組間比較采用Bonferroni法比較，兩組間比較采用t檢驗。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

圖1 實驗者三個部位中TNF-α的表達以肌肉組織中最高，與其他部位TNF-α的表達相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。

圖2 對照組各組織中TNF-α表達相比無統(tǒng)計學(xué)差異。

圖3 實驗組與對照組肌肉組織中TNF-α的表達相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。

3 討論

軟組織損害性疼痛是臨床常見病、多發(fā)病，宣蟄人[1]對其病因、發(fā)病機制、診斷及治療等方面做了系統(tǒng)的研究，運用軟組織壓痛點強刺激推拿、密集型銀質(zhì)針、軟組織松解手術(shù)等手段針對慢性軟組織損害性疼痛病灶進行治療，取得了優(yōu)良的臨床治愈顯效率。董宏然等[3]對椎管外重度軟組織損害性疼痛患者采用針對軟組織病灶的松解手術(shù)治療，平均隨訪5年8個月，優(yōu)良率達95%。急性損傷后遺或慢性勞損等原因引起運動系統(tǒng)軟組織損害，筋膜、肌肉、韌帶、關(guān)節(jié)囊等軟組織出現(xiàn)無菌性炎癥病變，引起疼痛及其他相關(guān)征象，但無菌性炎癥的本職仍不清楚。近年來，細胞因子在慢性疼痛中的作用越來越受到重視，TNF-α的作用尤其引起人們的重視[4]，被認(rèn)為是一種神經(jīng)調(diào)節(jié)劑，相關(guān)機制的闡明為臨床疼痛的治療提供了新的依據(jù)。但以臨床上腰腿痛病人為研究對象，檢查其外周不同組織中TNF-α的表達，尚未見相關(guān)報道。本研究以臨床中腰臀部軟組織損害性腰腿痛病人為實驗對象，以腰椎間盤突出癥病人為對照組，能更真實地反應(yīng)不同致痛機理下兩組病人的實際病理狀況，通過檢測兩組病人外周不同軟組織中TNFα的表達水平，進一步探討其可能的作用機制。

TNF-α是由單核-巨噬細胞產(chǎn)生的一種多肽細胞因子，具有廣泛的生物學(xué)活性，是參與多種生理和免疫反應(yīng)過程的重要介質(zhì)，同其它細胞因子共同參與維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等生理過程，同時介導(dǎo)感染、創(chuàng)傷及免疫應(yīng)答反應(yīng)。研究表明，TNF-α能促進炎癥細胞釋放炎癥介質(zhì)，增強中性粒細胞及單核細胞的粘附作用，誘導(dǎo)其它細胞因子（如IL-1、IL-6等）的產(chǎn)生，加重炎癥反應(yīng)，并參與疼痛的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。朱干等[5]發(fā)現(xiàn)，TNF-α可直接對神經(jīng)、血管組織產(chǎn)生影響，也可以刺激其他細胞產(chǎn)生致病物質(zhì)，還能作用于炎性細胞和局部神經(jīng)組織的鞘細胞，導(dǎo)致更多的TNF-α的生成。內(nèi)源性的TNF-α在神經(jīng)源性疼痛的發(fā)生、發(fā)展中也有著重要的作用，而且主要是通過與其受體TNF-RⅠ結(jié)合后發(fā)揮作用。已知TNF-α的兩種受體P55（TNF-RⅠ）和P75（TNF-RⅡ），在神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞上皆有表達，并且與TNF-α有較好的親和力，發(fā)揮不同的生理學(xué)作用[6]。TNF-α可以誘導(dǎo)神經(jīng)根髓鞘損傷、軸突變性，又可以引起神經(jīng)傳導(dǎo)功能障礙，痛覺變得更加敏感。高峰等[7]的研究認(rèn)為，外周的傷害性信息傳入可以增加脊髓背角TNF-α的釋放，并通過激活TNFR上調(diào)NR1亞基的磷酸化，從而引起機體慢性疼痛的發(fā)生和發(fā)展。

本研究發(fā)現(xiàn)TNF-α在臨床兩組病人的不同外周組織中均有表達，但慢性軟組織損害性疼痛病人外周三個不同部位軟組織中TNF-α的表達以肌肉組織中明顯增高，與對照組相比有顯著差異，而對照組三個部位軟組織中TNF-α的表達無統(tǒng)計學(xué)差異，說明TNF-α在軟組織損害引起的疼痛中可能起著重要的作用，具體的機制尚需要進一步研究；實驗組病例肌肉組織中TNF-α表達水平最高，且與另兩部位相比有顯著差異，提示肌肉組織是軟組織損害性疼痛的主要病灶部位，也是針對軟組織疼痛病灶進行治療時的重點部位。

[1] 宣蟄人.宣蟄人軟組織外科學(xué)[M].上海：文匯出版社，2002.11-25.

[2] Collins M，Bartelt RR，Houtman JC. T cell receptor activation leads to two distinct phases of pyk2 activation and actin cytoskeletal rearrangement in human T cells[J]. Mol Immunol，2010，47（9）：1665-1674.

[3] 董宏然，王全美.椎管外軟組織松解手術(shù)治療慢性軟組織疼痛100例遠期療效分析[J].中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志，2011，17：322-324.

[4] Baron R，Peripheral neuropathic pain：from mechanisms to symptoms[J]. Clin J Pain，2000，16（2）S12-20.

[5]朱干，張盛強，黃彪，等.腰椎間盤突出癥患者疼痛程度與TNF水平相關(guān)性研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2010，17（4）：8-9.

[6]Boka G，Angade P，Wallach D，et al. Immunocytochemical analysis of tumor necrosis factor and its receptors in Parkinson，sdisease[J]. Neurosci Lett，1994，172：151-154.

[7]高峰，趙欣，史瑞紅，等.TNF-α在脊髓背角參與慢性疼痛機制的研究[J].中國醫(yī)療前沿，2011，5（6）：15-16.