IFN－γ、IL－4、IL－17在小鼠哮喘模型不同階段的變化及其意義

唐玉紅，趙國(guó)斌，楊繼雷，周 艷

（1.河北北方學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，河北 張家口075000；2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院泌尿外科，河北 張家口075000；3.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院老年科，河北 張家口075000）

過(guò)敏性哮喘是一種由過(guò)敏原誘導(dǎo)的慢性氣道炎癥，輔助性T細(xì)胞 （T helper cells，Th）可以通過(guò)分泌不同的細(xì)胞因子來(lái)調(diào)節(jié)其發(fā)展。過(guò)敏原活化的Th2細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子白介素 （interleukin，IL）－4、IL－5、IL－13在過(guò)敏性氣道炎癥的誘導(dǎo)和維持中起著重要作用[1]。而Th1細(xì)胞可以通過(guò)分泌IFN－γ在組織中介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，在抗胞外細(xì)菌感染中發(fā)揮一定作用，也可以促進(jìn)自身免疫病的發(fā)展[2]。正常情況下，Th1和Th2細(xì)胞處于平衡狀態(tài)，過(guò)敏原活化的Th2細(xì)胞會(huì)抑制Th1型細(xì)胞因子的合成，Th1細(xì)胞也可以通過(guò)分泌IFN－γ抑制嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的增殖和分化，抑制哮喘炎癥反應(yīng)。

Th17細(xì)胞可以分泌IL－17家族細(xì)胞因子 （包括IL－17，IL－22等），其主要功能是參與中性粒細(xì)胞的招募、活化和遷移[3]。IL－17在Th17細(xì)胞介導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、多發(fā)性硬化癥等慢性炎癥中發(fā)揮重要作用。越來(lái)越多的數(shù)據(jù)表明Th1和Th17細(xì)胞也參與了過(guò)敏性氣道炎癥的發(fā)生，尤其是嚴(yán)重型哮喘。本研究以小鼠作為研究對(duì)象，觀察Th1、Th2和Th17細(xì)胞代表性細(xì)胞因子IFN－γ、IL－4和IL－17在不同時(shí)期哮喘中的變化，探討其在哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

40只清潔級(jí)BALB／c小鼠，雄性，鼠齡4～6周，體質(zhì)量18～20g，購(gòu)自斯貝福 （北京）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司 [生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （京）2011－0004]。卵白蛋白 （OVA）：V級(jí)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。細(xì)胞因子測(cè)定試劑盒：購(gòu)自美國(guó)Biosource公司。10%氫氧化鋁凝膠：抗原佐劑，自行配制。地塞米松磷酸鈉注射液 （DXM）：吉林敖東藥業(yè)集團(tuán)生產(chǎn)。霧化器：德國(guó)百瑞有限公司生產(chǎn)。酶標(biāo)儀：美國(guó)伯樂公司生產(chǎn)。

1.2 方法

40只小鼠隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組8只，模型對(duì)照組8只，哮喘模型組24只。

1.2.1 模型的建立

0.1%卵白蛋白氫氧化鋁溶液 （100μL／鼠）兩后爪皮下注射作首次致敏，10d后，用等量卵白蛋白氫氧化鋁溶液腹腔注射加強(qiáng)致敏。d 15開始，將小鼠置于密閉玻璃容器內(nèi)，以1%卵白蛋白生理鹽水溶液霧化攻擊，每天0.5h。健康對(duì)照組不做任何處理，模型對(duì)照組致敏同模型組，用生理鹽水進(jìn)行霧化攻擊，每天0.5h，連續(xù)6d。

1.2.2 樣本的收集與處理

哮喘模型組在霧化攻擊進(jìn)行了6d、10d和14d后分別隨機(jī)選取8只小鼠，乙醚麻醉后摘眼球取血，4℃、1 000r·min－1，離心10min，收集血清分裝于Ep管中，－80℃保存，用于檢測(cè)細(xì)胞因子。脫頸椎處死小鼠，打開胸腔，氣管插管，以D－h(huán)anks液1mL行支氣管－肺泡灌洗，重復(fù)3次，得支氣管肺泡灌洗液 （BALF）約0.8mL。取50μL加入等量白細(xì)胞計(jì)數(shù)液，在低倍鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。剩余BALF 4℃、1 000r·min－1，離心5min，收集上清液，分裝于Ep管中，－80℃保存，用于檢測(cè)細(xì)胞因子。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組與6d哮喘組同時(shí)處理。

1.2.3 細(xì)胞因子測(cè)定

采用小鼠ELISA試劑盒測(cè)定，具體方法按照試劑盒內(nèi)說(shuō)明書操作，根據(jù)光密度值 （A）計(jì)算含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 氣道炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)

哮喘模型組BALF中炎癥細(xì)胞數(shù)量明顯均高于正常對(duì)照組 （P＜0.01），說(shuō)明哮喘模型的建立是成功的[4]，且哮喘14d組BALF中炎癥細(xì)胞數(shù)量高于哮喘6d組。模型對(duì)照組與健康對(duì)照組沒有明顯差異（表1）。

表1 氣道炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

2.2 BALF中細(xì)胞因子的濃度

由于模型對(duì)照組炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)與健康對(duì)照組沒有差異，因此細(xì)胞因子未做檢測(cè) （表2）。

表2 各組小鼠BALF中細(xì)胞因子濃度比較 （pg·mL－1）

2.2.1 不同時(shí)間哮喘小鼠模型BALF中IFN－γ的濃度變化

不同時(shí)間哮喘模型組 （6d、10d、14d）BALF中IFN－γ濃度均明顯低于正常對(duì)照組 （P＜0.05），且哮喘14d組IFN－γ濃度明顯低于哮喘6d組 （P＜0.05）（圖1）。

圖1 ELISA檢測(cè)不同時(shí)間哮喘小鼠模型BALF中IFN－γ的濃度 （▲P＜0.05）

2.2.2 不同時(shí)間哮喘小鼠模型BALF中IL－4的濃度變化

不同時(shí)間哮喘模型組 （6d、10d、14d）BALF中IL－4濃度均明顯高于正常對(duì)照組 （P＜0.01），且哮喘14d組IL－4濃度明顯高于哮喘6d組 （P＜0.05）（圖2）。

2.2.3 不同時(shí)間哮喘小鼠模型BALF中IL－17的濃度變化

不同時(shí)間哮喘模型組 （6d、10d、14d）BALF中IL－17濃度均明顯高于正常對(duì)照組 （P＜0.05），且哮喘14d組IL－17濃度明顯高于哮喘6d組 （P＜0.05）。

圖2 ELISA檢測(cè)不同時(shí)間哮喘小鼠模型BALF中IL－4的濃度 （★P＜0.05，＊P＜0.01）

圖3 ELISA檢測(cè)不同時(shí)間哮喘小鼠模型BALF中IL－17的濃度 （★P＜0.05）

2.3 血清中細(xì)胞因子的濃度 （表3）

表3 各組小鼠血清中細(xì)胞因子濃度比較 （pg·mL－1）

3 討 論

CD4＋T細(xì)胞包括Th1、Th2、Th17等亞群是哮喘炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)器，這些淋巴細(xì)胞的功能主要是通過(guò)分泌細(xì)胞因子來(lái)實(shí)現(xiàn)的。例如Th2細(xì)胞可以分泌IL－4等細(xì)胞因子來(lái)促進(jìn)IgE的產(chǎn)生和嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，在哮喘的發(fā)生發(fā)展中起重要作用；而Th1細(xì)胞則可以通過(guò)分泌IL－12和IFN－γ來(lái)促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答，對(duì)哮喘有一定的保護(hù)作用，但也有報(bào)道說(shuō)Th1細(xì)胞能夠促進(jìn)哮喘炎癥發(fā)展[5]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子也參與了過(guò)敏性哮喘的病理過(guò)程。文獻(xiàn)報(bào)道，氣道高反應(yīng)性程度對(duì)吸入過(guò)敏原后的應(yīng)答有明顯的影響[6]。因此，檢測(cè)哮喘模型不同發(fā)病階段的細(xì)胞因子水平能夠從一定程度上反應(yīng)Th細(xì)胞在哮喘不同階段的變化，進(jìn)一步闡明哮喘的發(fā)病機(jī)制。

本研究中，哮喘模型組氣道炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增加，且隨著攻擊次數(shù)的增多，炎癥浸潤(rùn)程度也越來(lái)越嚴(yán)重。但不同時(shí)間段哮喘模型間，炎癥浸潤(rùn)程度并無(wú)明顯差異，可能除炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)外，其它因素也會(huì)參與氣道高反應(yīng)性。

已經(jīng)證實(shí)IFN－γ在胞內(nèi)細(xì)菌感染時(shí)有一定的保護(hù)作用，并參與自身免疫病的發(fā)生。在過(guò)敏性哮喘中，IFN－γ與氣道單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)，并能抑制Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL－4，進(jìn)而抑制IgE的分泌，對(duì)哮喘有一定的保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，哮喘模型組血清和BALF中IFN－γ水平明顯低于正常對(duì)照組，說(shuō)明Th1應(yīng)答在哮喘發(fā)病過(guò)程中減弱了。相反，過(guò)敏性哮喘患者血清和BALF中IL－4水平明顯升高，且隨著霧化次數(shù)的增加，其濃度也逐漸升高。研究表明，Th2型細(xì)胞因子 （IL－4、IL－5、IL－9、IL－13等）及IgE介導(dǎo)的肺部嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主的炎癥反應(yīng)是哮喘發(fā)病的關(guān)鍵啟動(dòng)因素[1]。在哮喘發(fā)生時(shí)，除嗜酸性粒細(xì)胞外，其它炎性細(xì)胞如淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等在肺部的浸潤(rùn)也會(huì)增多，同時(shí)這些炎性細(xì)胞分泌的IL－4也會(huì)增多。IL－4能進(jìn)一步促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而加重哮喘的炎癥反應(yīng)；同時(shí)，Th1分化減弱，所以IL－4也能間接抑制IFN－γ的產(chǎn)生。

過(guò)敏性哮喘小鼠模型證實(shí)，接觸過(guò)敏原能上調(diào)Th17細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子，而IL－17能誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞的招募和聚集[7]。故IL－17在過(guò)敏性哮喘的發(fā)病機(jī)制中有重要作用，能夠調(diào)節(jié)氣道炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，哮喘發(fā)生后，血清和BALF中IL－17水平均明顯升高。我們推測(cè)過(guò)敏原能誘導(dǎo)Th17細(xì)胞活化，從而分泌IL－17增多，且濃度隨著哮喘嚴(yán)重程度持續(xù)升高。大部分臨床研究也表明，Th17細(xì)胞在局部過(guò)敏性氣道炎癥的發(fā)展中有重要作用：肺部、痰液和BALF中的Th17細(xì)胞因子水平均明顯升高[8]。過(guò)敏性哮喘患者外周血中產(chǎn)IL－17的Th細(xì)胞會(huì)參與對(duì)致敏原的應(yīng)答[9]。因此，相對(duì)于健康對(duì)照者來(lái)說(shuō)，過(guò)敏性哮喘患者外周血IL－17濃度會(huì)明顯升高，且其水平會(huì)隨著哮喘的加重而持續(xù)上升[10]。

綜上所述，哮喘發(fā)生時(shí)，小鼠血清和BALF中IFN－γ濃度降低，而IL－4和IL－17濃度升高，且其變化趨勢(shì)與哮喘嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，BALF中霧化6d組和14d組之間細(xì)胞因子水平有明顯差異，而血清中差異不明顯。說(shuō)明哮喘炎癥反應(yīng)是以氣道局部為主的，盡管過(guò)敏原刺激氣道后，也會(huì)誘導(dǎo)外周血炎癥細(xì)胞數(shù)量升高[11]。

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