微生物纖維二糖脂的活性及其應用研究進展*

李宏吉，范琳琳，蔡 瑾，張 俊，陳啟和

(浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，浙江杭州，310058)

纖維二糖脂(cellobiose lipid，CL)是一種糖脂類生物表面活性劑，與鼠李糖脂、海藻糖脂、槐糖脂［1］和甘露糖赤蘚糖醇脂［2］等相比，是現(xiàn)今國內(nèi)研究最少的一類糖脂。它主要可通過黑粉菌目的Ustilago maydis［3］，Pseudozyma fusiformata［4］，Pseudozyma graminicola［5］，Pseudozyma flocculosa［6-8］，Sympodiomycopsis paphiopedili［9］，同擔子菌綱的 Cryptococcus humicola［10］以及 Pseudozyma aphidis［11］和 Pseudozyma hubeiensis［11］等發(fā)酵烷烴、植物油甚至葡萄糖等得到，發(fā)酵方法主要包括生長細胞法和靜息細胞法，F(xiàn)rautz等［12］研究表明，在氮限制條件下利用靜息細胞法生產(chǎn)CL的產(chǎn)量更高，如今由P．graminicola CBS10092發(fā)酵生產(chǎn)的純化CL的最高產(chǎn)量可達(0．62±0．35)g/L［11］，而報道的第1種纖維二糖脂——由致植物病真菌Ustilago maydis所產(chǎn)的黑粉菌酸(ustilagic acid，UA)(結(jié)構(gòu)見圖 1［13］)的產(chǎn)量僅為(0．27 ± 0．02)g/L［11］。不同微生物發(fā)酵產(chǎn)CL的結(jié)構(gòu)并不相同(見表1)，但其原因尚不明確，推測是與參與CL的生物合成的編碼酶的基因有關(guān)。

圖1 黑粉菌酸(UA)的結(jié)構(gòu)類型［13］Fig．1 Structure of ustilagic acid(UA)［13］

CL有著化學表面活性劑不可比擬的優(yōu)勢，毒性低，可生物降解性好，有良好的乳化性和表面活性以及抗真菌性，并且活性pH范圍廣，具有熱穩(wěn)定性，可廣泛應用于石油污染現(xiàn)場的防治、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。CL是一種新的最有研究前途的糖脂之一，但相關(guān)研究并不多，俄羅斯、日本和德國的一些學者對其結(jié)構(gòu)、活性，特別是生物學活性進行了部分研究［3-5，8-12，14］。但國內(nèi)尚未見其功能特性及其在應用方面的研究，因此本文綜述了國內(nèi)外有關(guān)CL的生物活性和應用方面的研究現(xiàn)狀，并進行了展望，以期為CL的相關(guān)活性的應用研究提供參考。

表1 發(fā)酵生產(chǎn)CL的微生物種類、發(fā)酵條件及其產(chǎn)物類型Table 1 Microorganisms，fermentation conditions，and the structures of CL

1 CL的生物學活性

1.1 CL抗真菌活性

目前，國外學者對CL的活性研究主要集中在它的抗真菌性以及相關(guān)機理。CL主要對一些酵母菌和絲狀真菌具有抗菌活性，包括念珠菌屬(candidosis)和隱球菌屬(cryptococcosis)，如白色念珠菌(Candida albicans)和新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)［4，7-8，15-16］。Beom 等［17］認為由 Ps．Flocculosa分泌產(chǎn)生的纖維二糖脂具有兩親結(jié)構(gòu)，而這種兩親結(jié)構(gòu)可以融入細胞質(zhì)膜，導致膜通透性增加和細胞死亡，從而達到抗菌目的。無獨有偶，Kulakovskaya等［18］研究發(fā)現(xiàn)UA可以引起敏感酵母的膜變更和通透性的改變，從而導致ATP泄露。Puchkov［15］等認為由Cryptococcus humicola分泌產(chǎn)生的纖維二糖脂混合物(mycocidal complex，MC)可以插入脂質(zhì)雙分子層，使其結(jié)構(gòu)改變，使其膜的通透率也隨著糖脂濃度的增加而增加?？傊?，纖維二糖脂主要通過改變菌體細胞膜的通透性使其內(nèi)容物流出而達到殺菌的目的。

研究表明，CL的抗真菌活性與pH值、微生物來源有關(guān)。如T．porosum分泌產(chǎn)生的纖維二糖脂在pH 3．5～4．0的范圍內(nèi)才會有抗真菌活性，在 pH 4．5或更高的pH范圍內(nèi)是沒有活性的，纖維二糖脂在酸性pH環(huán)境下達到最大活性的原因可能是這種活性需要羧基群的離子化［10］。而 Tatyana Kulakovskaya 等［14］利用 Cr．humicola 9-6 和 Ps．fusiformata VKM Y-2821經(jīng)過一系列培養(yǎng)發(fā)酵純化分析發(fā)現(xiàn)它們所產(chǎn)生的CL的結(jié)構(gòu)并不相同并且研究了它們的結(jié)構(gòu)對于抗真菌活性的影響，得出如下結(jié)論:CL結(jié)構(gòu)中碳水化合物部分和脂肪酸糖苷配基都會影響CL的抗真菌活性。它們的脂肪酸殘基中包含著羥基群，這種獨特的結(jié)構(gòu)和纖維二糖殘基中不同的O-取代基使其具有抗真菌活性。

不同微生物分泌產(chǎn)生的CL的抗真菌譜也不相同。如Ps．fusiformata和Sym．paphiopedili對屬于子囊菌門和擔子菌門中的300個檢測物種中的幾乎所有的酵母、酵母類似菌和絲狀真菌有抗菌活性［19］，而T．porosum分泌產(chǎn)生的CL對包括對人、動物和植物都具有致病性的子囊菌類和擔子菌類的真菌具有很高的活性［10］，U．maydis對于一些細菌和真菌具有抗菌活性［20］，Ps．Flocculosa 則對一些真菌、細菌以及原核生物中的革蘭氏陽性菌具有很強的抗菌活性［17］。而且，一種微生物分泌產(chǎn)生的CL對不同的真菌的抑制濃度是不同的。如對于地生隱球酵母來說，Ps．fusiformata產(chǎn)生的糖脂引起ATP泄露對其的最低影響濃度為0．03 mg/mL，而對于釀酒酵母來說，相應的濃度卻是0．04 mg/mL［4］。但是，不同微生物分泌產(chǎn)生的CL對所研究的真菌卻顯示了幾乎一樣的抗真菌活性(表1、表2)。從表中可見，Cr．humicola 9-6和Ps．Fusiformata產(chǎn)生的CL都可對C．a(chǎn)lbicans、C．glabrata、C．viswanathii、F．neoformans和 Cl．lusitaniae這些在醫(yī)學中很重要的菌種產(chǎn)生抑制作用［14］。由于其抗菌范圍廣、作用的pH值范圍寬且其具有熱穩(wěn)定性，所以使得CL成為有前景的天然的病原菌生物防治劑，并且可有效防止食品和飼料的真菌污染［21］。

CL的抗真菌活性研究大多處于實驗室研究階段，如不同真菌對于不同菌種分泌產(chǎn)生的CL的敏感性不同、CL的結(jié)構(gòu)對于其抗真菌活性的影響和CL對于不同真菌的抑制濃度等，隨著研究深入，應該考慮將CL的這一特殊特性應用于實踐中。針對日常生活中常見的致病性真菌確定能產(chǎn)生相應抑制其生長的CL的菌株、抑制濃度等等，進行大量的動物實驗確定其安全性，并在實用性、生產(chǎn)成本等方面進行完善，旨在為實際產(chǎn)業(yè)做出貢獻。

表1 Cr.humicola 9－6、Ps.fusiformata和Trichosporon porosum VMK－2956產(chǎn)生的CL在培養(yǎng)30 min后引起培養(yǎng)基中幾乎所有細胞死亡的濃度Table 1 The concentrations of cellobiose lipids of Cr.humicola 9－6，Ps.fusiformata and Trichosporon porosum VMK－2956 causing almost complete death of the cells of test cultures after 30 min incubation

表2 在p H 4.0，Cr.humicola 9－6和Ps.fusiformata產(chǎn)生15～20 mm生長抑制區(qū)域的條件下所需CL的數(shù)量［14］Table 2 The amount of cellobiose lipids of Cr.humicola 9－6 and Ps.fusiformata giving 15～20 mm zones of growth inhibition at pH 4.0［14］

1.2 其他活性

CL作為糖脂，還具有優(yōu)良的表面活性。由Cryptococcus humicola分泌產(chǎn)生的0．5 mg/mL MC可以把0．1 mol/L的NaHCO3的表面張力從71 mN/m減少到37 mN/m，把正十六烷的界面張力從39 mN/m減少到10 mN/m。在相同的實驗條件下，其表面活性強于常用表面活性劑十二烷基三甲基溴化銨DTAB，與十二烷基磺酸鈉SDS相當［14］。并且具有化學合成表面活性劑不可比擬的優(yōu)勢，若提高其產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，會成為一種很好的商品表面活性劑。

另外，CL特點在于在酸性pH條件下達到最大活性，具有熱穩(wěn)定性［7，14，22］且對動物細胞的毒性低［7-8］。這些特點使得CL在很多領(lǐng)域如食品工業(yè)、生物除污、生物制藥等方面有潛在的發(fā)展應用前景。

CL是兩性分子，其分子是由疏水部分和親水部分共同構(gòu)成，在作為生物表面活性劑的同時也可以加強疏水營養(yǎng)成分的利用［23］。這一特性使得CL可以作為食品添加劑用于一些保健品中，促進人體對與疏水營養(yǎng)成分的利用。

2 CL的產(chǎn)業(yè)應用

2.1 CL在環(huán)境生物工程中的應用

一些酵母菌和絲狀真菌會產(chǎn)細胞外糖脂［21，24］，例如甘露糖赤蘚糖醇脂、槐糖脂和纖維二糖脂，它們均可用做生物表面活性劑，可以促進有機疏水物質(zhì)的溶解和被微生物細胞所消耗［21，24-25］。

在很多土壤污染的案例中，由工業(yè)活動引起的環(huán)境污染都是由于意外的或蓄意的將有機和或無機物質(zhì)排放到環(huán)境中。由于這些物質(zhì)很容易被土壤微粒所吸附，所以環(huán)境修復成了一個難題。在有機物質(zhì)例如碳氫化合物造成的環(huán)境污染的修復過程中，生物表面活性劑的應用主要是提高有機物質(zhì)的生物利用度或者在洗滌處理中時，通過使污染物溶液化和乳化，使其流動并達到清除的目的。另一方面，在無機物如重金屬所造成的環(huán)境污染的修復過程中，生物表面活性劑的應用主要是與重金屬結(jié)合成螯合物，并在洗滌步驟中去除這樣的離子，這一處理主要依賴于兩親化合物和金屬離子的化學相互作用［26］。

在海洋污染的案例中，應用最多的是石油污染現(xiàn)場的生物補救 (Bioremediation)方面［27］。過去，石油污染的解決方法主要是通過蒸發(fā)、風干和由細菌引起的油降解來移除污染物，這種天然的生物降解過程非常緩慢［28］，而化學分散劑會導致生態(tài)破壞［29］。針對這個問題，生物表面活性劑可以發(fā)揮作用。雖然烴類物質(zhì)可由降解菌通過β-氧化途徑降解，但石油烷烴的憎水性是微生物代謝的主要障礙。而CL作為兩親物質(zhì)，可以乳化石油烷烴并促進石油烷烴的生物降解，其原因是因為CL的親水基朝向細胞質(zhì)而疏水基朝向介質(zhì)，這樣就使微生物細胞的親油性增大，細胞壁與油相介質(zhì)的γI降低，介質(zhì)分子圍繞細胞形成單分子油層，并被動擴散進入細胞內(nèi)［30］。雖然目前CL作為生物表面活性劑并未投入到實際應用中，但是理論上的可行性和實踐中的成功例子，都會促進其廣泛應用。在環(huán)境保護的重要性日益增加的今天，該研究必將逐步受到重視并在實際應用中發(fā)揮作用。

2.2 CL作為天然抗菌劑

在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中，合成殺菌劑對于植物疾病的有效防治不可或缺［31-32］。然而，一些合成殺菌劑因為對環(huán)境有害以及因為抗藥性的出現(xiàn)導致其逐漸停止使用。有研究表明，微生物代謝產(chǎn)物可以提供新的化學結(jié)構(gòu)，這種化學結(jié)構(gòu)使得它們具有不易與商業(yè)殺菌劑產(chǎn)生交叉抗藥性的新的作用方式［33-34］。另外，類似CL這樣的代謝產(chǎn)物很容易降解，通常幾天就可以被分解掉。在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中，這樣的特性使其具有明顯的應用優(yōu)勢。例如P．flocculosa對于白粉菌具有很好地抗性，其分生孢子已被制成名為“Sporodex”的生物抗菌劑并投入產(chǎn)業(yè)化市場［35］。

2.3 CL用于食品、藥品行業(yè)

CL還可應用于食品行業(yè)，主要是基于其特有的抗真菌活性。CL具有顯著抗真菌活性，且抗菌范圍廣，研究表明這種活性可能是因為CL具有產(chǎn)生一種叫做小菌素的低分子量的殺傷毒素的能力［22］，這種小菌素類似于低分子量的細菌素［15］。由C．humicola分泌產(chǎn)生的CL與最常見的抗真菌藥物——制霉菌素(nystatin)在相同的實驗條件下進行評估，發(fā)現(xiàn)它們的最低抑制濃度分別是5～10μg/mL和1～5μg/mL，這意味著 CL具有相對較高的抗真菌活性［36］。而且其對動物細胞的毒性低，所以應用于食品工業(yè)中可以很好地保存食品和飼料，降低其被真菌污染所造成的損失。而應用在醫(yī)藥工業(yè)中，也是基于其特有的抗真菌活性，CL抗真菌譜非常廣，對幾乎所有的酵母、酵母類似菌和絲狀真菌都有抗菌活性且高效低毒。在真菌感染特別是深部真菌感染的發(fā)病率急劇增加而真菌耐藥性問題日益嚴重的今天［37］，CL為未來抗真菌藥物的發(fā)展提供了無限可能。

3 問題和展望

CL是一種新型糖脂類生物表面活性劑。由于其突出的抗真菌活性及其在食品、醫(yī)藥、石油污染防治等領(lǐng)域的應用前景，CL的研究逐漸引起人們重視。但是相關(guān)研究尚未成熟，僅局限于實驗室階段，未能實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化應用。對此，應從以下幾個方面重點研究。

篩選新型發(fā)酵菌種。在不斷尋找新菌種的同時，可以考慮采用基因工程技術(shù)改良現(xiàn)有菌種，篩選高產(chǎn)菌種或獲得突變體，使得某些低表達菌種變成高表達菌種，并針對相應高產(chǎn)菌種，通過改良發(fā)酵生產(chǎn)條件或工藝，進一步提高產(chǎn)物產(chǎn)量。同時，改進提純工藝，借助色譜技術(shù)并聯(lián)用多種分離純化手段，盡可能找到一種耗時較短、分離純化率高、有機試劑使用量小、低成本的分離純化方法。

首先解決了CL生產(chǎn)上的問題，使得CL的生產(chǎn)能達到商業(yè)化生產(chǎn)水平。其次，應該針對CL的相應特性，研發(fā)可用于食品、環(huán)境、藥品等領(lǐng)域的商品性質(zhì)的CL，如除污劑、抗真菌藥物等。

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