PCR-DGGE 法在水體微生物多樣性研究中的應(yīng)用

焦晨JIAO Chen；夏甜XIA Tian

（①內(nèi)蒙古化工職業(yè)學(xué)院材料工程系，呼和浩特 010070；②內(nèi)蒙古化工職業(yè)學(xué)院思政理論教研部，呼和浩特 010070）

（①Department of Materials Engineering，Inner Mongolia Vocational College of Chemical Engineering，Hohhot 010070，China；②Ideological and Political Theory Teaching and Research Department，Inner Mongolia Vocational College of Chemical Engineering，Hohhot 010070，China）

1 湖泊水體系微生物生態(tài)學(xué)

1.1 湖泊水體系微生物多樣性 ①藻類(lèi)，常見(jiàn)的藻類(lèi)約56 個(gè)屬138 個(gè)種，包括：硅藻、裸藻、金藻、甲藻、小球藻屬，柵列藻屬，以及藍(lán)細(xì)菌等。②細(xì)菌，在被研究水體中BOD 符合負(fù)荷值比較低、維持好氧狀態(tài)的富營(yíng)養(yǎng)話(huà)水體中，常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)菌群有芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、產(chǎn)甲烷菌屬、光和細(xì)菌屬、硫酸鹽還原菌等。③原生動(dòng)物及微型后生動(dòng)物，富營(yíng)養(yǎng)化水體中常見(jiàn)固著型纖毛蟲(chóng)、鞭蟲(chóng)、甲殼類(lèi)、搖蚊幼蟲(chóng)等。

1.2 湖泊水體系微生物間的相互關(guān)系 位于食物鏈中的各種生物與其生存環(huán)境間通過(guò)一系列的能量和物質(zhì)的轉(zhuǎn)移與循環(huán)保持著相互依存的穩(wěn)定關(guān)系，即生態(tài)平衡。但當(dāng)湖泊水體系中大量累積N、P 等營(yíng)養(yǎng)元素時(shí)，生態(tài)系統(tǒng)的平衡就被破壞，主要表現(xiàn)為藻類(lèi)通過(guò)大量繁殖，數(shù)量明顯增多，進(jìn)而導(dǎo)致水體透明度下降和臭閾值增加。經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證，向湖泊水體系中投加復(fù)合細(xì)菌能與原有水體中微生物形成共生增殖關(guān)系，從而使藻類(lèi)優(yōu)勢(shì)種群無(wú)法形成，起到了強(qiáng)化水體生物自?xún)裟芰?，恢?fù)湖泊生態(tài)平衡的作用。

2 微生物多樣性分析的常用方法

2.1 水體微生物多樣性的傳統(tǒng)研究方法 水體微生物多樣性的傳統(tǒng)研究方法是先將被檢測(cè)水體樣品中的微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)純培養(yǎng)后獲得純菌株，再研究純菌株的特征及細(xì)胞性質(zhì)，最后總結(jié)特性。但由于微生物形態(tài)簡(jiǎn)單，個(gè)體較小，僅依靠外觀形態(tài)觀察無(wú)法獲得太多信息，且自然界中大多數(shù)微生物無(wú)法依靠純培養(yǎng)分離，也不能精確鑒定分離物，進(jìn)而揭示分離物間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

2.2 分子生物學(xué)技術(shù) 應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)研究水體微生物生態(tài)學(xué)，能夠在一定程度上避免微生物多樣性丟失及種群構(gòu)成變化等問(wèn)題的發(fā)生，有利于被研究水體微生物中新的菌株、新菌種的發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步提高對(duì)環(huán)境微生物多樣性的認(rèn)知水平。

3 應(yīng)用PCR-DGGE 技術(shù)進(jìn)行水體微生物多樣性檢測(cè)的原理、步驟和主要優(yōu)缺點(diǎn)

3.1 應(yīng)用PCR-DGGE 技術(shù)進(jìn)行水體微生物多樣性檢測(cè)的原理 本論文擬采用基于凝膠中不同DNA 片段電泳遷移率差異的變性梯度凝膠電泳DGGE 技術(shù)分離被研究水體系微生物的DNA。

如圖1 將尿素和甲酰胺等DNA 變性劑添加到聚丙烯酰胺凝膠中，使溶液呈現(xiàn)線性的變性劑濃度梯度變化。在電泳過(guò)程中水體微生物的DNA 雙鏈分子在變性凝膠中逐步進(jìn)行解鏈，形成解鏈區(qū)域，此接連區(qū)域的形成增大了DNA 分子的遷移阻力。當(dāng)?shù)竭_(dá)一定變性劑濃度，水體微生物的DNA 分子在變性凝膠中的解鏈程度恰好合適，DNA分子所受到的遷移阻力與周?chē)妶?chǎng)力互相平衡時(shí)，DNA分子便停留在該變性濃度的聚丙烯酰胺凝膠中。DNA 雙鏈分子由于堿基排列順序不一樣解鏈區(qū)域及解鏈行為也不相同，導(dǎo)致雖然處于同種變性凝膠電泳環(huán)境中，其遷移行為也不一致，因此可以在其周?chē)妶?chǎng)作用下得到分離。

為了提高被研究水體樣品中微生物多樣性的檢驗(yàn)精確度和檢出率，能夠更好的反映被檢測(cè)水體微生物的實(shí)際情況，徹底分離DNA 片段，在PCR 擴(kuò)增過(guò)程時(shí)將GC 發(fā)夾結(jié)構(gòu)添加到正向引物的5'端，使其在PCR 過(guò)程中，通過(guò)擴(kuò)增連接到目的DNA 雙鏈分子片段的一端上[1]，使其在含有變性劑的電泳凝膠中難以完全解鏈而形成DNA 單鏈。由于單鏈DNA 在DGGE 凝膠中的電泳行為完全取決于DNA 的分子大小，而與DNA 的堿基排列順序無(wú)關(guān)，因此DGGE 電泳無(wú)法將其完全分離。因此，可以說(shuō)只要將檢測(cè)過(guò)程中的電泳條件設(shè)置合適且其滿(mǎn)足條件足夠細(xì)致，哪怕僅有一個(gè)堿基區(qū)別的DNA 片段也可以被區(qū)分。

應(yīng)用PCR-DGGE 技術(shù)在水體微生物多樣性研究中具有以下優(yōu)點(diǎn)：檢測(cè)極限低；檢測(cè)速度快；檢測(cè)費(fèi)用低；結(jié)果有較強(qiáng)的客觀性；能夠針對(duì)多個(gè)樣品及多種微生物進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)；可以結(jié)合其他檢測(cè)方法提高檢測(cè)質(zhì)量。

3.2 PCR-DGGE 技術(shù)分析微生物多樣性的主要實(shí)施步驟：①環(huán)境樣品微生物DNA 的提?。虎诃h(huán)境樣品微生物DNA 的純化；③Touch-down PCR[2]；④GC 發(fā)夾；⑤染色和測(cè)序。

3.3 PCR-DGGE 技術(shù)分析研究水體系微生物多樣性的局限性 如同任何檢測(cè)分析技術(shù)一樣，PCR-DGGE 技術(shù)分析微生物多樣性也存在一定的局限性，其局限性主要表現(xiàn)在如下幾個(gè)方面：①存在DNA 片段檢測(cè)的最理想長(zhǎng)度一般在200～500bp 之間，所以能夠提供的生物系統(tǒng)發(fā)育信息具有局限性[3]。②在湖泊水體系微生物多樣性檢測(cè)中，由于被研究水體樣品中個(gè)別種類(lèi)的微生物16S rDNA 在復(fù)制時(shí)的異質(zhì)性問(wèn)題及異源核酸雙鏈分子的檢出影響，會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏離真實(shí)值略高。③DNA 片段擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物由于受到具有不同序列的DNA 共遷移問(wèn)題的影響，DGGE 電泳圖譜中可能出現(xiàn)同一條帶中含有不同種類(lèi)的微生物，這將導(dǎo)致對(duì)湖泊水體環(huán)境微生物的多樣性估計(jì)偏低。同時(shí)受到電泳條件的影響，也不能保證具有序列差異的DNA 片段完全分離。④無(wú)法還原被研究水體中微生物在生活環(huán)境中的真實(shí)圖景，也無(wú)法提供微生物數(shù)量、群落新陳代謝活性和基因水平等研究信息，需要進(jìn)一步結(jié)合微電極測(cè)量或熒光原位雜交等其他技術(shù)方法對(duì)被研究水體系中的微生物進(jìn)行更詳盡地群落的復(fù)雜性分析。⑤DGGE凝膠電泳技術(shù)雖然可以檢測(cè)到占有超過(guò)全部研究水體系的整個(gè)群落微生物數(shù)量1%的優(yōu)勢(shì)菌群的存在，但仍無(wú)法將被研究水體樣品中環(huán)境微生物群落的復(fù)雜性完整地體現(xiàn)出來(lái)。對(duì)于以上技術(shù)方法中存在的檢測(cè)缺陷，可以從改善PCR 擴(kuò)增及DGGE 電泳條件著手；同時(shí)將與其他傳統(tǒng)的技術(shù)檢測(cè)方法與DGGE 電泳技術(shù)進(jìn)行有機(jī)的結(jié)合、相互補(bǔ)充，這樣將被研究水體系微生物群落的代謝、數(shù)量、結(jié)構(gòu)和功能等情況的動(dòng)態(tài)變化更貼近實(shí)際地反映出來(lái)，并進(jìn)一步將原位生理等環(huán)境中微生物的多樣性信息進(jìn)行表達(dá)，從而不斷提高分析微生物生態(tài)學(xué)的研究水平。

4 總結(jié)

本文擬使用PCR-DGGE 分子生物技術(shù)分析研究水體微生物群落多樣性，使用該方法的研究較少目前仍然沒(méi)有明確出一種具體的、行之有效的方法來(lái)對(duì)微生物群落多樣性研究進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)的后續(xù)性研究擬從傳統(tǒng)培養(yǎng)方法上對(duì)各種菌體進(jìn)行更全面的研究，進(jìn)而將分子生物技術(shù)在水體微生物群落多樣性上建立起一套快捷、可靠的分析方法，在對(duì)水體微生物處理以及富營(yíng)養(yǎng)化水體的治理研究中起到相應(yīng)的作用。

[1]曾薇,楊慶,張樹(shù)軍等.采用FISH、DGGE 和Cloning 對(duì)短程脫氮系統(tǒng)中硝化菌群的比較分析[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2006,26(5).

[2]刑德峰,任南琪,宋業(yè)穎等.DG-DGGE 分析產(chǎn)氫發(fā)酵系統(tǒng)微生物群落動(dòng)態(tài)及種群多樣性[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2005,25(7).

[3]陳桐生,李建軍,岑英華等.DG-DGGE 分析除臭生物濾池微生物多樣性及富集后的種群結(jié)構(gòu)差異[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2006,12(1).