血管抑素和內(nèi)皮細胞抑制素在血管增生性皮膚病中的表達及意義

張平 李琳 李凱 程楊 姜硯 王向東 陳柳青 王瑋蓁

血管抑素和內(nèi)皮細胞抑制素在血管增生性皮膚病中的表達及意義

張平 李琳 李凱 程楊 姜硯 王向東 陳柳青 王瑋蓁

目的分析不同類型血管增生性皮膚病中血管抑素(AS)和內(nèi)皮細胞抑制素(ES)的表達情況。方法選取毛細血管瘤、海綿狀血管瘤、蔓狀血管瘤、化膿性肉芽腫病理切片43份,新鮮組織19份,正常皮膚作為對照,分別作免疫組化及熒光定量PCR檢測AS與ES在不同組織中的分布與表達水平。結(jié)果AS、ES在各組織血管內(nèi)皮細胞胞質(zhì)及胞膜上均有一定的表達,毛細血管瘤中AS和ES的陽性細胞率分別為(15.77±5.92)%,(19.35±7.81)%,基因表達量分別是正常皮膚的2.4和2.7倍;其他各型血管增生性病變與正常組織的表達量比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論AS、ES在毛細血管瘤內(nèi)高表達,提示二者可能通過特異性作用于增殖活躍的血管瘤內(nèi)皮細胞,在血管瘤的發(fā)病機制中發(fā)揮一定的生物學(xué)作用。

血管抑素類;內(nèi)皮抑素類;血管瘤,毛細管;血管瘤,海綿狀;肉芽腫,膿性

作者單位:430022武漢市第一醫(yī)院皮膚科

血管增生性皮膚病常見的有血管瘤、血管畸形、化膿性肉芽腫等,其病因、發(fā)病機制、治療方式以及轉(zhuǎn)歸各不相同,組織病理均以血管內(nèi)皮細胞異常增殖、血管形成為特點。血管形成受促血管生長因子和抗血管生成因子、血流動力學(xué)等多種因素調(diào)節(jié),血管抑素(angiostatin,AS)和內(nèi)皮細胞抑制素(endostatin,ES)是近年發(fā)現(xiàn)的血管生長抑制因子。人AS是血漿纖溶酶原的內(nèi)源片段,有rK1～rK4袢樣結(jié)構(gòu),能特異性抑制血管內(nèi)皮細胞增殖,其中rK1-3的抑制作用最強[1-2]。ES是另一種內(nèi)源性血管生長抑制因子,由組織蛋白酶L和金屬蛋白酶通過水解ⅩⅧ型膠原C末端而產(chǎn)生[3]。兩者都能特異性阻斷新生血管的形成,但其作用機制、作用靶點以及抑制作用的強弱在不同組織中存在較大差異。本研究采用免疫組化和實時熒光定量PCR檢測AS與ES在不同類型血管性皮膚病中的分布及表達量,比較分析二者在血管增生性皮膚病發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。

一、資料與方法

1.組織來源:選擇2011年5月至2012年12月本院病理科經(jīng)HE染色確診的石蠟塊43例,其中毛細血管瘤17例(鮮紅斑痣除外),平均年齡0.91歲,男女比例7:10;海綿狀血管瘤16例,平均年齡15.6歲;蔓狀血管瘤3例,化膿性肉芽腫7例,正常皮膚組織切片做對照。選取2013年皮膚科及兒外科手術(shù)新鮮組織標本19例,年齡71 d至42歲,術(shù)后病理確診為毛細血管瘤5例,海綿狀血管瘤7例,蔓狀血管瘤2例,化膿性肉芽腫5例,各組間年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義。19例患者術(shù)前均未服用糖皮質(zhì)激素或普萘洛爾,未進行激光、冷凍和局部注射治療,取幼兒包皮組織6例做對照,收集所有新鮮組織立即-80℃凍存。

2.主要試劑:兔抗人AS/ES多克隆抗體產(chǎn)自美國Proteintech Group公司,抗兔通用型免疫組化試劑盒REALTMEnVision+/HRP RABBIT由丹麥Dako Denmark A/S公司生產(chǎn)。反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)、dNTP、Olig(dT)、2×Top Green qPCR Mix、TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix均產(chǎn)自中國Transgen公司,Trizol產(chǎn)自美國Invitrogen公司;PCR引物上海由生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

3.SP免疫組化:取43例皮膚血管病變組織及4例正常皮膚組織蠟塊切片、烤片,二甲苯脫脂,乙醇水化,抗原修復(fù),SP免疫組化測定,鹽酸二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,蘇木素復(fù)染,中性樹膠封片。用已知的AS/ES陽性表達的人肝細胞為陽性對照,以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗為陰性對照。

4.實時熒光定量PCR:19例血管增生性皮膚病新鮮組織標本及6例正常組織總RNA提取。Primer5軟件設(shè)計引物,AS上游引物:5'-CCAGTGCCAGC AGACCCTT-3',下游引物:5'-CTCCGAATCTCGCCCTCTAG-3',擴增片段為245 bp。ES上游引物:5'-GACCACGGCTCGATT TCTCC-3',下游引物:5'-CAG ATGGCCTTGTGCTGAGTG-3',擴增片段176 bp。以β肌動蛋白為內(nèi)參照,反應(yīng)在美國ABI公司ABI7300熒光定量PCR儀上進行。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3min,94℃變性10 s,56℃退火20 s,72℃延伸20 s,共40個循環(huán)。20 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定AS、ES產(chǎn)物分別在245 bp及176 bp。

5.統(tǒng)計學(xué)處理:SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行原始數(shù)據(jù)匯總和數(shù)據(jù)分析。AS和ES表達水平采用±s表示,采用雙尾t檢驗比較兩組間差異,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 毛細血管瘤免疫組化結(jié)果(SP) 1a,1c:大量增殖活躍的血管內(nèi)皮細胞呈團塊狀,細胞團中央形成含紅細胞的小腔隙(×200);1b:內(nèi)皮細胞胞質(zhì)豐富、透明,可見較大深染的細胞核及正常的核分裂象,較多內(nèi)皮細胞胞質(zhì)內(nèi)和胞膜上有棕黃色顆粒沉積(×400)

圖2 海綿狀血管瘤(SP×200) 血管內(nèi)皮細胞無異常增殖,排列成薄壁管腔,管周見正常網(wǎng)狀結(jié)締組織。部分內(nèi)皮細胞胞質(zhì)和包膜上見棕黃色顆粒沉積。2a:血管抑素;2b:內(nèi)皮抑制蛋白

圖3 蔓狀血管瘤(SP×200) 鏡下見直徑較大、壁厚、不規(guī)則的小動脈及靜脈。個別血管內(nèi)皮細胞胞質(zhì)中有棕黃色顆粒沉積。3a:血管抑素;3b:內(nèi)皮抑制蛋白

圖4 化膿性肉芽腫(SP×200) 鏡下見豐富的新生毛細血管,大量血管內(nèi)皮細胞增生,形成薄壁管腔,內(nèi)皮細胞無核分裂相。小部分內(nèi)皮細胞胞質(zhì)內(nèi)、胞膜上見棕黃色顆粒沉積。4a:血管抑素;4b:內(nèi)皮抑制蛋白

二、結(jié)果

1.免疫組化染色:以細胞質(zhì)和胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達,用目鏡測微網(wǎng)光學(xué)顯微鏡下人工計數(shù),每張切片隨機選取5個視野(×400),每個視野計數(shù)100個細胞,計算陽性細胞百分比。AS與ES在各類型血管性皮膚病及正常皮膚組織的血管內(nèi)皮細胞均有表達,彌散分布于內(nèi)皮細胞的胞質(zhì)、胞膜,極少數(shù)分布在周細胞中(圖1～4)。毛細血管瘤中AS、ES陽性細胞百分比均高于其他組(表1),差異有統(tǒng)計學(xué)意義;海綿狀血管瘤與蔓狀血管瘤組織中大部分血管內(nèi)皮細胞處于退化期或靜止狀態(tài),可見較大血管腔隙,兩者與正常皮膚間差異無統(tǒng)計學(xué)意義;化膿性肉芽腫以新生毛細血管為主,AS/ES陽性細胞百分比與正常組織間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.RT-PCR反應(yīng):紫外分光光度計測定總RNAA260/A280比值在1.71～2.06之間,依據(jù)PCR擴增曲線及熔解曲線分析擴增效率好,產(chǎn)物單一,能得到可靠的相對定量結(jié)果。毛細血管瘤組AS、ES的表達水平分別是正常皮膚組織的2.363 3和2.732 3倍,其他各組AS和ES的表達均略低于正常對照組(表2)。

表1 各類血管性皮膚病中AS與ES陽性細胞率比較(±s)

表1 各類血管性皮膚病中AS與ES陽性細胞率比較(±s)

注:AS:血管抑素;ES:內(nèi)皮細胞抑制素

組別 例數(shù) AS(%) t值 P值 ES(%) t值 P值正常皮膚 4 3.46±1.77 4.27±1.88毛細血管瘤 17 15.77±5.92 4.04 ＜0.01 19.35±7.81 3.77 ＜0.01海綿狀血管瘤 16 5.09±2.31 1.31 ＞0.05 6.32±3.27 1.19 ＞0.05蔓狀血管瘤 3 1.78±1.23 1.39 ＞0.05 2.58±1.43 1.29 ＞0.05化膿性肉芽腫 7 4.14±2.89 0.42 ＞0.05 4.79±2.25 0.39 ＞0.05

表2 各類血管性皮膚病中AS、ES的表達水平(±s)

表2 各類血管性皮膚病中AS、ES的表達水平(±s)

注:AS:血管抑素;ES:內(nèi)皮細胞抑制素

毛細血管瘤 5 0.104 1±0.091 7 2.363 3 0.431 5±0.315 0 2.732 3海綿狀血管瘤 7 0.030 7±0.020 1 0.697 6 0.146 7±0.106 3 0.929 1蔓狀血管瘤 2 0.031 1±0.019 3 0.705 6 0.125 8±0.071 6 0.796 7化膿性肉芽腫 5 0.029 1±0.027 2 0.659 9 0.110 4±0.055 1 0.698 8正常皮膚 6 0.044 0±0.041 1 1.000 0 0.157 9±0.104 3 1.000 0組別 例數(shù) AS ES 2-△Ct 2-△△Ct 2-△Ct 2-△△Ct

三、討論

AS、ES是近年發(fā)現(xiàn)的最有潛力的血管生成抑制因子,二者在抑制腫瘤血管新生治療中的作用被廣泛認同,已明確AS/ES對增殖活躍的內(nèi)皮細胞作用顯著,而對正常成熟的、靜止狀態(tài)的內(nèi)皮細胞及其他細胞無影響[4-5]。我們推測,AS與ES在血管增生性皮膚病的發(fā)病過程中也可能發(fā)揮一定的作用,且對血管瘤、血管畸形及化膿性肉芽腫的作用機制存在差異。

本研究應(yīng)用免疫組化及RT-PCR對不同類型血管增生性皮膚病中的AS與ES的表達進行了分析,發(fā)現(xiàn)AS與ES在毛細血管瘤、海綿狀血管瘤、蔓狀血管瘤及化膿性肉芽腫的血管內(nèi)皮細胞中均有不同程度表達,特別是在毛細血管瘤中二者表達量明顯升高,為正常皮膚組織和其他型血管病變的2～3倍,該結(jié)果說明AS和ES可能在血管瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮一定的生物學(xué)作用。AS與ES在蔓狀血管瘤和處于靜止狀態(tài)的海綿狀血管瘤、化膿性肉芽腫及正常皮膚中的表達量無明顯差異,進一步說明AS/ES能選擇性作用于增殖活躍的血管瘤內(nèi)皮細胞,而對靜止狀態(tài)及正常成熟血管內(nèi)皮細胞無影響,其作用具有特異性。AS/ES可能影響血管瘤的形成,而與血管畸形的發(fā)病無相關(guān)性,這與ISSVA對血管瘤和血管畸形的特點的概括相符。AS與ES對血管生成的抑制作用一致,但機制不同。研究表明,AS可以和腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞表面的多種受體結(jié)合,包括三磷酸腺苷(ATP)合成酶α/β亞單位(抑制內(nèi)皮細胞表面ATP的代謝,下調(diào)內(nèi)皮細胞的增殖和遷移[6])、angiomotin、整合素 αvβ3(干擾血管生成過程中所依賴的αvβ3介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[7])等,從而抑制新生血管的形成[8]。ES可通過肝素結(jié)合位點,激活酪氨酸激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),減少處于S期細胞比例,促進血管內(nèi)皮細胞凋亡;通過抑制抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL的表達,阻斷VEGF及基質(zhì)金屬蛋白酶MMP的活性等多種途徑抑制新生血管形成[9]。AS與ES在血管瘤的發(fā)生、演變過程中的作用機制、作用靶點是否與抗腫瘤新生血管的機制相同,兩者在抑制血管生成的作用中是否具有協(xié)同作用,尚需進一步研究。

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2013-07-26)

(本文編輯:尚淑賢)

Expressions of angiostatin and endostatin in vascular proliferative skin diseases and their clinical implications

Zhang Ping,Li Lin,Li Kai,Cheng Yang,Jiang Kun,Wang Xiangdong,Chen Liuqing,Wang Weizhen.Department of Dermatology,Wuhan First Hospital,Wuhan 430022,China

Wang Weizhen,Email:weizhenwang2007@aliyun.com

ObjectiveTo investigate the expressions of angiostatin and endostatin in different vascular proliferative skin diseases.MethodsThis study included 43 paraffin-embedded and 19 fresh skin tissue specimens from the lesions of patients with vascular proliferative skin diseases(such as capillary hemangioma,cavernous hemangioma,hemangioma racemosum,and pyogenic granuloma)as well as 6 fresh skin tissue specimens from the foreskin of infants.Immunohistochemistry and real-time qPCR were used to determine the expression pattern and levels of angiostatin and endostatin in these specimens.ResultsBoth angiostatin and endostatin were expressed to a certain extent in the membrane and cytoplasm of vascular endothelial cells in these specimens of vascular proliferative skin diseases.The expression rates of angiostatin and endostatin in capillary hemangioma tissue specimens were 15.77%±5.92%and 19.35%±7.81%respectively,with their relative expression levels being 2.4 and 2.7 times those in the normal control skin specimens.No significant differences were observed in the expression level of angiostatin or endostatin between the normal control skin and lesions of the other vascular proliferative skin diseases(allP＞0.05).ConclusionsAngiostatin and endostatin are highly expressed in capillary hemangioma tissue,suggesting that they play biological roles in the pathogenesis of hemangioma via specifically acting against actively proliferating vascular endothelial cells.

Angiostatins;Endostatins;Hemangioma,capillary;Hemangioma,cavernous;Granuloma,pyogenic

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.06.022

武漢市衛(wèi)生局科研項目(WX11C07)

王瑋蓁,Email:weizhenwang2007@aliyun.com