Pinx1、hTERT mRNA在三種皮膚腫瘤組織中的表達(dá)及意義

陳前明 方杰 瓦慶彪 袁偉 吳波 蔡琦 路永紅 周培媚 蔣存火

·研究報(bào)道·

Pinx1、hTERT mRNA在三種皮膚腫瘤組織中的表達(dá)及意義

陳前明 方杰 瓦慶彪 袁偉 吳波 蔡琦 路永紅 周培媚 蔣存火

目的探討內(nèi)源性端粒酶抑制基因PinX1及端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT在基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、日光性角化病組織中的表達(dá)及其意義。方法實(shí)時(shí)定量PCR檢測實(shí)驗(yàn)組36例3種皮膚腫瘤組織中內(nèi)源性端粒酶抑制基因PinX1及端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT的mRNA表達(dá)水平,并以15例正常人皮膚組織作為對照組。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組PinX1基因的mRNA表達(dá)水平(2.53±1.57)低于對照組(4.25±2.02),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.273,P＜0.05);hTERT基因的mRNA表達(dá)水平(6.37±3.81)明顯高于對照組(1.62±0.99),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.927,P＜0.05);Pinx1的表達(dá)水平與hTERT表達(dá)的相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論P(yáng)inX1的下調(diào)及hTERT上調(diào)可能與3種皮膚腫瘤形成過程中端粒酶激活及維持機(jī)制有關(guān)。

皮膚腫瘤;基因,Pinx1;基因,hTERT

作者單位:610017成都市第二人民醫(yī)院皮膚科(陳前明、瓦慶彪、吳波、蔡琦、路永紅、周培媚、蔣存火);遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科(方杰、袁偉)

端粒酶活性增強(qiáng)可導(dǎo)致細(xì)胞永生化、腫瘤形成。內(nèi)源性端粒酶抑制基因PinX1(PIN2/TERF1 interacting,telomerase inhibitor 1)基因是在人類細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)能與端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT直接相互作用的新的端粒酶/端粒調(diào)控因子,被推測為潛在的抑癌基因,目前發(fā)現(xiàn),在人類包括肝癌、前列腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤中明顯降低或無表達(dá)[1]。已有研究表明,在皮膚腫瘤中端粒酶活性高于正常皮膚組織[2]。本研究通過檢測基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌和日光性角化病組織中,PinX1和hTERT的mRNA表達(dá)水平,初步探討PinX1在3種皮膚腫瘤發(fā)病機(jī)制中的作用。

一、對象與方法

(一)對象:收集2012年3月至2013年3月遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院及成都第二人民醫(yī)院3種皮膚腫瘤手術(shù)標(biāo)本36例,其中男15例,女21例,年齡41～93歲,平均60歲,包括基底細(xì)胞癌13例、鱗狀細(xì)胞癌11例、日光性角化病12例。正常皮膚組織取自遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院外科手術(shù)切除的正常皮膚,其中男9例,女6例,年齡22～65歲,平均39歲。本研究都經(jīng)過兩家醫(yī)院醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者均簽署知情同意書。所有標(biāo)本均為手術(shù)切除,經(jīng)組織病理診斷,標(biāo)本離體10min內(nèi)置入凍存管內(nèi),放入-80℃低溫冰箱保存。

(二)主要試劑及儀器:熒光定量PCR儀購于美國Bio-Rad公司,紫外分光光度計(jì)購于美國Beckman Coulter公司,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系試劑盒及SYBR Green I嵌合熒光法試劑盒均購于大連TakaPa公司,PinX1、hTERT引物及內(nèi)參還原磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)引物均由上海Sangon公司設(shè)計(jì)合成,引物序列見表1。

(三)方法:

1.提取總RNA,合成cDNA:取組織100mg用Trizol一步法[3]提取組織內(nèi)總RNA。所提取的總RNA用紫外分光光度計(jì)測定A260/A280含量并檢測其純度,1.5%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。篩選所有比值在1.8～2.0之間且無降解的樣品,取2 μg總RNA按反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系試劑盒說明合成cDNA。cDNA放入-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 PinX1、hTERT、GAPDH 引物序列

2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR:以cDNA為模板,用Bio-Rad熒光定量PCR儀按照SYBR Green I嵌合熒光法試劑盒說明書檢測PinX1、hTERT基因mRNA在基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、日光性角化病及正常皮膚組織中的表達(dá)。擴(kuò)增反應(yīng)條件:PinX1 PCR:預(yù)變性95℃ 10 s,1個(gè)循環(huán):變性95℃ 10 s,退火(復(fù)性)55℃30 s,40個(gè)循環(huán);GAPDH PCR:預(yù)變性95℃10 s,1個(gè)循環(huán);變性95℃ 10 s,退火60℃30 s,40個(gè)循環(huán);hTERT PCR:預(yù)變性95℃10 s,1個(gè)循環(huán);變性95℃ 10 s,退火60℃30 s,40個(gè)循環(huán)。用2-△△Ct法對有特異性擴(kuò)增的目的基因進(jìn)行相對定量。反應(yīng)結(jié)束后分析PCR擴(kuò)增曲線及熔解曲線,并進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測擴(kuò)增特異性。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:用SPSS13.0軟件對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗(yàn),兩組基因mRNA的相對表達(dá)量的相關(guān)性進(jìn)行Pearson線性相關(guān)分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

1.總RNA純度和完整性:A260/A280樣本比值在1.8～2.0之間,提示總RNA純度良好;在紫外線燈下可見28S、18S和5S三條大小和比例合適的條帶,表明提取的總RNA無降解。

2.PinX1及hTERT mRNA的表達(dá)水平:PinX1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖在127 bp處可見明顯的電泳條帶(圖1),hTERT基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖在96 bp處可見明顯的電泳條帶(圖2),GAPDH基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖在258 bp處可見明顯的電泳條帶(圖3)。

3.PinX1基因mRNA的相對表達(dá)量:BCC、SCC、AK組織中PinX1 mRNA的相對表達(dá)量均低于正常對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05),見表2。3種皮膚腫瘤之間兩兩比較PinX1 mRNA的相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05);3種皮膚腫瘤組織中PinX1 mRNA的相對表達(dá)量低于正常對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.273,P＜0.01),見表2。

4.hTERT基因mRNA的相對表達(dá)量:BCC、SCC、AK組織中hTERT mRNA的相對表達(dá)量均高于正常對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。3種皮膚腫瘤之間兩兩比較hTERT mRNA的相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05);3種皮膚腫瘤組織中hTERT mRNA的相對表達(dá)量明顯高于正常對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.927,P＜0.001)。見表2。

5.PinX1與hTERT mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析:PinX1與hTERT mRNA相對表達(dá)量的Pearson相關(guān)系數(shù)為0.016,P=0.913,兩者的相關(guān)關(guān)系無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、日光性角化病組織中PinX1、hTERT mRNA的相對表達(dá)量(±s)

表2 基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、日光性角化病組織中PinX1、hTERT mRNA的相對表達(dá)量(±s)

組別 例數(shù) PinX1 hTERT基底細(xì)胞癌 13 2.26±1.38 5.90±2.94鱗狀細(xì)胞癌 11 2.62±1.92 6.82±5.14日光性角化病 12 2.75±1.50 6.45±3.51正常對照組 15 4.25±2.02 1.62±0.99

圖1 PinX1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖 M:標(biāo)準(zhǔn)參照物;1:空白對照;2～4:PinX1擴(kuò)增片段(127 bp)

圖2 hTERT基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖 M:標(biāo)準(zhǔn)參照物;1～3:hTERT擴(kuò)增片段(96 bp);4:空白對照

圖3 GAPDH基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖 M:標(biāo)準(zhǔn)參照物;1,2:GAPDH擴(kuò)增片段(258 bp);3:空白對照

三、討論

端粒(telomere)作為線性DNA,其末端不能被DNA酶復(fù)制,因此它的末端會(huì)隨周期性的復(fù)制而逐漸縮短,從而使細(xì)胞逐漸衰老或凋亡[4]。而端粒酶能以自身RNA為模板合成端粒DNA,并加至端粒末端以維持端粒長度的穩(wěn)定,抵消因各種原因造成的端粒的縮短及不穩(wěn)定[5-6]。正常情況下人類體細(xì)胞端粒酶的檢測是陰性的,但85%以上的腫瘤樣品能檢測到端粒酶的存在[7]。人類端粒酶有3個(gè)主要組分:人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)、人端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)和端粒酶相關(guān)蛋白(telomerase associated protein,TEP1)[8]。其中hTERT是端粒酶活性表達(dá)所必需的。作為RNA依賴的DNA聚合酶,hTERT可識別單鏈富含G的寡核苷酸引物,以其RNA組分的堿基為模板與端粒重復(fù)序列進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對,在合成、延伸端粒堿基序列中起催化作用[9]。

作為內(nèi)源性端粒酶抑制基因,PinX1基因由7個(gè)外顯子組成,有兩種轉(zhuǎn)錄形式,分別編碼174個(gè)氨基酸和328個(gè)氨基酸[10]。其定位于8p23,該區(qū)域同時(shí)也是一個(gè)在多種人類腫瘤中發(fā)生高頻雜合缺失的區(qū)域。PinX1在正常人體組織中廣泛表達(dá),而在腫瘤組織中則相應(yīng)低表達(dá)或不表達(dá),不能有效抑制端粒酶活性而阻遏腫瘤生長。在體外,過度表達(dá)PinX1可抑制纖維肉瘤HTl080細(xì)胞的增殖,抑制端粒酶活性、縮短端粒長度引發(fā)危機(jī)狀態(tài);相反,抑制內(nèi)源性PinX1可促進(jìn)瘤細(xì)胞的增殖,增加端粒酶活性、延長端粒[11]。

PinX1可以抑制端粒酶活性,而有研究表明在基底細(xì)胞癌、皮膚鱗狀細(xì)胞癌中端粒酶都有過多的表達(dá)[2]。本研究結(jié)果顯示,作為端粒酶活性表達(dá)所必需的基因,hTERT基因在BCC、SCC、AK組織中的表達(dá)水平明顯高于正常組織(P＜0.05),提示3種皮膚腫瘤組織中端粒酶活性可能高于正常組織。PinX1基因在BCC、SCC、AK組織中的表達(dá)水平低于正常皮膚組織(P＜0.05),表明在端粒酶活性增強(qiáng)的3種皮膚腫瘤組織中,PinX1下調(diào)后,端粒酶活性可能不能被PinX1有效抑制,從而使端粒長度得到維持,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長。

[1]馬英玉,武良,李繼承.Pinx1表達(dá)與端粒酶活性及腫瘤的關(guān)系[J].細(xì)胞生物學(xué)雜志,2008,30:472-474.

[2]Chen Z,Smith KJ,Skelton HG,et al.Telomerase activity in Kaposi's sarcoma,squamous cell carcinoma,and basal cell carcinoma[J].Exp Biol Med,2001,226(8):753-757.

[3]趙志龍,宗志紅,李建新,等.從石蠟包埋肺癌組織提取檢測基因轉(zhuǎn)錄的研究[J].中國肺癌雜志,2008,11(8):563-565.

[4]Johnson FB.PinX1 the tail on the chromosome[J].J Clin Invest,2011,121(4):1242-1244.

[5]Grandin N,Charbonneau M.Protection against chromosome degradation at the telomeres[J].Biochimie,2008,90(1):41-59.

[6]Bianchi A, Shore D.How telomerase Reaches Its End:Mechanism of Telomerase Regulation by the Telomeric Complex[J].Mol Cell,2008,31(2):153-165.

[7]Rhyu MS.Telomeres,telomerase,and immortality[J].J Natl Cancer Inst,1995,87(12):884-894.

[8]Marcia B,Christophe N.Regulation of Telomerase and Telomeres:Human Tumor Viruses Take Control[J].J Natl Cancer Inst,2008,100(2):98-108.

[9]Gillis AJ,Schuller AP,Skordalakes E.Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT[J].Nature,2008,455(7213):633-637.

[10]WS Park,Lee JH,et al.Genetic analysis of the liver putative tumor suppressor(LPTS)gene in hepatocellular carcinomas[J].Cancer Lett,2002,178(2):199-207.

[11]Zhou XZ,Lu KP.The Pin2/TRF1-interacting protein PinX1 is a potent telomerase inhibitor[J].Cell,2001,107(3):347-359.

2013-08-19)

(本文編輯:吳曉初)

Expressions of PinX1 and hTERT mRNAs in three skin tumors and their significance

Chen Qianming*,Fang Jie,Wa Qingbiao,Yuan Wei,Wu Bo,Cai Qi,Lu Yonghong,Zhou Peimei,Jiang Cunhuo.*Department of Dermatology,Second People's Hospital of Chengdu,Chengdu 610017,China

Yuan Wei,Email:dryuanweihua@sina.com

ObjectiveTo investigate the mRNA expressions of PinX1 and hTERT in lesions of three skin tumors(including basal cell carcinoma(BCC),squamous cell carcinoma(SCC)and actinic keratosis)as well as their significance.MethodsThis study included 36 tissue specimens from the lesions of 13 patients with BCC,11 patients with SCC and 12 patients with actinic keratosis,as well as 15 tissue specimens from the normal skin of 15 individuals receiving surgical therapy.Real-time PCR was performed to quantify the mRNA expressions of PinX1 and hTERT in these specimens.ResultsThe specimens from the lesions of the skin tumors showed a significantly lower expression of PinX1 mRNA(2.53±1.57 vs.4.25±2.02,t=3.273,P＜0.05),but a higher expression of hTERT mRNA(6.37±3.81 vs.1.62±0.99,t=6.927,P＜0.05)compared with those from the normal skin.There was no significant correlation between the mRNA expressions of PinX1 and hTERT(P＞0.05).Conclusion The down-regulated PinX1 expression and up-regulated hTERT expression may be associated with the activation and maintenance of telomerase in the formation of the three skin tumors.

Skin neoplasms;Genes,Pinx1;Genes,hTERT

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.06.015

四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2010SZ0015)

袁偉,Email:dryuanweihua@sina.com