納豆芽孢桿菌發(fā)酵液體外溶栓效果試驗

孫軍德等

摘要：納豆激酶是納豆芽孢桿菌的重要代謝產(chǎn)物。為探究納豆激酶的溶栓效果，以納豆浸提液、納豆激酶發(fā)酵液為供試材料，以雞血塊、人工血栓為供試反應(yīng)底物，觀察各反應(yīng)物的溶栓效果。試驗結(jié)果表明：納豆激酶發(fā)酵液、納豆浸提液有溶解人工血栓的作用；納豆激酶發(fā)酵液和納豆浸提液對雞血塊的溶解率分別為60%和52%。

關(guān)鍵詞：納豆芽孢桿菌；納豆激酶發(fā)酵液；體外溶栓

中圖分類號：S154.39 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1674-1161（2014）06-0010-02

納豆原名豆豉，1754年由鑒真法師東渡弘法帶到日本。納豆激酶是一種具有強烈溶栓作用的絲氨酸蛋白酶，是納豆發(fā)酵過程中由納豆芽孢桿菌分泌產(chǎn)生的[1-3]。與其他溶栓藥物相比，納豆激酶具有溶栓效果好、易于提取、成本低廉、無任何毒副作用等優(yōu)勢[4]，被廣泛用于心腦血管疾病的預(yù)防。近年來，東南亞民間盛傳 “吃納豆預(yù)防血栓”“吃納豆能長壽”。納豆在我國也逐漸受到人們的青睞。通過體外溶栓試驗分析比較納豆浸提液和納豆芽孢桿菌發(fā)酵液的溶栓效果，旨在為納豆激酶溶栓特性研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌種 自行篩選得到1株納豆芽孢桿菌，保存于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院微生物學(xué)實驗室。

1.1.2 試劑藥品 牛纖維蛋白原和凝血酶購自遼寧省藥品檢驗所，其他藥品均購自國藥集團。液體培養(yǎng)基：每升含葡萄糖20 g，大豆蛋白胨10 g，NaCl 2 g，酵母膏1 g。

1.1.3 人工血栓的制備 將10 mg牛纖維蛋白原溶于1 mL無菌生理鹽水中，加入1 Bp凝血酶迅速混勻，37 ℃水浴靜置10 min，凝固形成人工血栓。

1.1.4 納豆浸提液的制備 取自制納豆2粒于10 mL無菌生理鹽水中，充分震蕩，該溶液即為納豆浸提液。

1.2 試驗方法

1.2.1 濃縮發(fā)酵液的提取 采用多次凍融法，將納豆芽孢桿菌發(fā)酵液在4 ℃，8 000 r/min下離心30 min，去除菌體；將上清液在-20 ℃冰箱中冷凍至完全固化，再在室溫下自然解凍，解凍至約有70%液體融化時，保存液體于-20 ℃冰箱中。重復(fù)此步驟，最終獲得的液體即為濃縮發(fā)酵液。

1.2.2 體外溶解人工血栓效果試驗 將10 mL納豆浸提液倒入裝有制備好的人工血栓培養(yǎng)皿中，蓋上培養(yǎng)皿蓋，在37 ℃條件下孵育數(shù)小時；用10 mL無菌生理鹽水做空白試驗，觀察兩組人工血栓的溶解情況。

1.2.3 血塊溶解率的計算 新鮮雞血在空氣中自然凝固后切成小塊，30 ℃烘干至恒重。每組取血塊2塊，稱重記為m0，分別放入10 mL納豆浸提液、0.9%無菌生理鹽水、納豆激酶濃縮發(fā)酵液和液體培養(yǎng)基中，37 ℃水浴反應(yīng)4 h，每30 min震蕩1次。反應(yīng)結(jié)束后用反應(yīng)液沖洗血塊，30 ℃烘干至恒重，稱量反應(yīng)后血塊質(zhì)量，計算血塊溶解率。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外溶解人工血栓

試驗發(fā)現(xiàn)，浸泡在納豆浸提液中的人工血栓體積明顯減小，而浸泡在生理鹽水中的人工血栓塊體積幾乎無變化，這說明納豆浸提液中確實含有能夠溶解血栓的有效成分，且效果較為顯著。

將濃縮納豆激酶發(fā)酵液倒入裝有人工血栓的Ep管中，37 ℃孵育數(shù)小時，觀察發(fā)現(xiàn)人工血栓幾乎完全溶解。

2.2 體外溶解血塊

不同溶液對雞血塊的溶解效果如表1所示。用多次凍融法得到的濃縮納豆激酶發(fā)酵液的溶血塊效果最為明顯，可達到60%；納豆浸提液的效果次之，可達到52%。這都遠遠大于兩個空白組，說明納豆芽孢桿菌所產(chǎn)的胞外溶解血栓的有效物質(zhì)——納豆激酶具有比較強的溶栓能力。

3 結(jié)論

1） 從體外溶解人工血栓的試驗效果可以看出，納豆浸提液與用多次凍融法提取的納豆激酶發(fā)酵液均可以溶解人工血栓，且納豆激酶發(fā)酵液溶解人工血栓的作用強于納豆浸提液。

2） 從體外溶解血塊的試驗可以得出，納豆激酶發(fā)酵液的溶血塊效果較為明顯，溶解率達到60%；納豆浸提液的溶解率為52%，均遠大于兩個空白組。

3） 試驗結(jié)果顯示，濃縮發(fā)酵液對人工血栓和血塊的溶解效果均大于納豆浸提液，這說明納豆芽孢桿菌產(chǎn)的溶解血栓的有效物質(zhì)——納豆激酶具有比較明顯的溶解血栓能力，且濃度越大效果越強。

參考文獻

[1] SUMI H，HAMADA H，TSUSHIMA H，et al.A novel fibrinolytic enzyme （nattokinase） in the vegetable cheese natto；a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J].Cellular and Molecular Life Sciences，1987，43（10）：1 110-1 111.

[2] FUJITA M，NOMURA K，HONG K， et al.Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme （nattokinase） in the vegetable cheese natto，a popular soybean fermented food in Japan[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，1993，197（3）：1 340-1 347.

[3] 朱健輝，杜連祥，路福平，等.高效溶栓酶——納豆激酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].微生物學(xué)通報，2006，33（1）：68-71.

[4] 王剛，郭明珠，陳光.枯草芽孢桿菌納豆激酶分離純化及酶學(xué)性質(zhì)[J].食品科學(xué)，2012，33（15）：231-234.

摘要：納豆激酶是納豆芽孢桿菌的重要代謝產(chǎn)物。為探究納豆激酶的溶栓效果，以納豆浸提液、納豆激酶發(fā)酵液為供試材料，以雞血塊、人工血栓為供試反應(yīng)底物，觀察各反應(yīng)物的溶栓效果。試驗結(jié)果表明：納豆激酶發(fā)酵液、納豆浸提液有溶解人工血栓的作用；納豆激酶發(fā)酵液和納豆浸提液對雞血塊的溶解率分別為60%和52%。

關(guān)鍵詞：納豆芽孢桿菌；納豆激酶發(fā)酵液；體外溶栓

中圖分類號：S154.39 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1674-1161（2014）06-0010-02

納豆原名豆豉，1754年由鑒真法師東渡弘法帶到日本。納豆激酶是一種具有強烈溶栓作用的絲氨酸蛋白酶，是納豆發(fā)酵過程中由納豆芽孢桿菌分泌產(chǎn)生的[1-3]。與其他溶栓藥物相比，納豆激酶具有溶栓效果好、易于提取、成本低廉、無任何毒副作用等優(yōu)勢[4]，被廣泛用于心腦血管疾病的預(yù)防。近年來，東南亞民間盛傳 “吃納豆預(yù)防血栓”“吃納豆能長壽”。納豆在我國也逐漸受到人們的青睞。通過體外溶栓試驗分析比較納豆浸提液和納豆芽孢桿菌發(fā)酵液的溶栓效果，旨在為納豆激酶溶栓特性研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌種 自行篩選得到1株納豆芽孢桿菌，保存于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院微生物學(xué)實驗室。

1.1.2 試劑藥品 牛纖維蛋白原和凝血酶購自遼寧省藥品檢驗所，其他藥品均購自國藥集團。液體培養(yǎng)基：每升含葡萄糖20 g，大豆蛋白胨10 g，NaCl 2 g，酵母膏1 g。

1.1.3 人工血栓的制備 將10 mg牛纖維蛋白原溶于1 mL無菌生理鹽水中，加入1 Bp凝血酶迅速混勻，37 ℃水浴靜置10 min，凝固形成人工血栓。

1.1.4 納豆浸提液的制備 取自制納豆2粒于10 mL無菌生理鹽水中，充分震蕩，該溶液即為納豆浸提液。

1.2 試驗方法

1.2.1 濃縮發(fā)酵液的提取 采用多次凍融法，將納豆芽孢桿菌發(fā)酵液在4 ℃，8 000 r/min下離心30 min，去除菌體；將上清液在-20 ℃冰箱中冷凍至完全固化，再在室溫下自然解凍，解凍至約有70%液體融化時，保存液體于-20 ℃冰箱中。重復(fù)此步驟，最終獲得的液體即為濃縮發(fā)酵液。

1.2.2 體外溶解人工血栓效果試驗 將10 mL納豆浸提液倒入裝有制備好的人工血栓培養(yǎng)皿中，蓋上培養(yǎng)皿蓋，在37 ℃條件下孵育數(shù)小時；用10 mL無菌生理鹽水做空白試驗，觀察兩組人工血栓的溶解情況。

1.2.3 血塊溶解率的計算 新鮮雞血在空氣中自然凝固后切成小塊，30 ℃烘干至恒重。每組取血塊2塊，稱重記為m0，分別放入10 mL納豆浸提液、0.9%無菌生理鹽水、納豆激酶濃縮發(fā)酵液和液體培養(yǎng)基中，37 ℃水浴反應(yīng)4 h，每30 min震蕩1次。反應(yīng)結(jié)束后用反應(yīng)液沖洗血塊，30 ℃烘干至恒重，稱量反應(yīng)后血塊質(zhì)量，計算血塊溶解率。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外溶解人工血栓

試驗發(fā)現(xiàn)，浸泡在納豆浸提液中的人工血栓體積明顯減小，而浸泡在生理鹽水中的人工血栓塊體積幾乎無變化，這說明納豆浸提液中確實含有能夠溶解血栓的有效成分，且效果較為顯著。

將濃縮納豆激酶發(fā)酵液倒入裝有人工血栓的Ep管中，37 ℃孵育數(shù)小時，觀察發(fā)現(xiàn)人工血栓幾乎完全溶解。

2.2 體外溶解血塊

不同溶液對雞血塊的溶解效果如表1所示。用多次凍融法得到的濃縮納豆激酶發(fā)酵液的溶血塊效果最為明顯，可達到60%；納豆浸提液的效果次之，可達到52%。這都遠遠大于兩個空白組，說明納豆芽孢桿菌所產(chǎn)的胞外溶解血栓的有效物質(zhì)——納豆激酶具有比較強的溶栓能力。

3 結(jié)論

1） 從體外溶解人工血栓的試驗效果可以看出，納豆浸提液與用多次凍融法提取的納豆激酶發(fā)酵液均可以溶解人工血栓，且納豆激酶發(fā)酵液溶解人工血栓的作用強于納豆浸提液。

2） 從體外溶解血塊的試驗可以得出，納豆激酶發(fā)酵液的溶血塊效果較為明顯，溶解率達到60%；納豆浸提液的溶解率為52%，均遠大于兩個空白組。

3） 試驗結(jié)果顯示，濃縮發(fā)酵液對人工血栓和血塊的溶解效果均大于納豆浸提液，這說明納豆芽孢桿菌產(chǎn)的溶解血栓的有效物質(zhì)——納豆激酶具有比較明顯的溶解血栓能力，且濃度越大效果越強。

參考文獻

[1] SUMI H，HAMADA H，TSUSHIMA H，et al.A novel fibrinolytic enzyme （nattokinase） in the vegetable cheese natto；a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J].Cellular and Molecular Life Sciences，1987，43（10）：1 110-1 111.

[2] FUJITA M，NOMURA K，HONG K， et al.Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme （nattokinase） in the vegetable cheese natto，a popular soybean fermented food in Japan[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，1993，197（3）：1 340-1 347.

[3] 朱健輝，杜連祥，路福平，等.高效溶栓酶——納豆激酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].微生物學(xué)通報，2006，33（1）：68-71.

[4] 王剛，郭明珠，陳光.枯草芽孢桿菌納豆激酶分離純化及酶學(xué)性質(zhì)[J].食品科學(xué)，2012，33（15）：231-234.

摘要：納豆激酶是納豆芽孢桿菌的重要代謝產(chǎn)物。為探究納豆激酶的溶栓效果，以納豆浸提液、納豆激酶發(fā)酵液為供試材料，以雞血塊、人工血栓為供試反應(yīng)底物，觀察各反應(yīng)物的溶栓效果。試驗結(jié)果表明：納豆激酶發(fā)酵液、納豆浸提液有溶解人工血栓的作用；納豆激酶發(fā)酵液和納豆浸提液對雞血塊的溶解率分別為60%和52%。

關(guān)鍵詞：納豆芽孢桿菌；納豆激酶發(fā)酵液；體外溶栓

中圖分類號：S154.39 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1674-1161（2014）06-0010-02

納豆原名豆豉，1754年由鑒真法師東渡弘法帶到日本。納豆激酶是一種具有強烈溶栓作用的絲氨酸蛋白酶，是納豆發(fā)酵過程中由納豆芽孢桿菌分泌產(chǎn)生的[1-3]。與其他溶栓藥物相比，納豆激酶具有溶栓效果好、易于提取、成本低廉、無任何毒副作用等優(yōu)勢[4]，被廣泛用于心腦血管疾病的預(yù)防。近年來，東南亞民間盛傳 “吃納豆預(yù)防血栓”“吃納豆能長壽”。納豆在我國也逐漸受到人們的青睞。通過體外溶栓試驗分析比較納豆浸提液和納豆芽孢桿菌發(fā)酵液的溶栓效果，旨在為納豆激酶溶栓特性研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌種 自行篩選得到1株納豆芽孢桿菌，保存于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院微生物學(xué)實驗室。

1.1.2 試劑藥品 牛纖維蛋白原和凝血酶購自遼寧省藥品檢驗所，其他藥品均購自國藥集團。液體培養(yǎng)基：每升含葡萄糖20 g，大豆蛋白胨10 g，NaCl 2 g，酵母膏1 g。

1.1.3 人工血栓的制備 將10 mg牛纖維蛋白原溶于1 mL無菌生理鹽水中，加入1 Bp凝血酶迅速混勻，37 ℃水浴靜置10 min，凝固形成人工血栓。

1.1.4 納豆浸提液的制備 取自制納豆2粒于10 mL無菌生理鹽水中，充分震蕩，該溶液即為納豆浸提液。

1.2 試驗方法

1.2.1 濃縮發(fā)酵液的提取 采用多次凍融法，將納豆芽孢桿菌發(fā)酵液在4 ℃，8 000 r/min下離心30 min，去除菌體；將上清液在-20 ℃冰箱中冷凍至完全固化，再在室溫下自然解凍，解凍至約有70%液體融化時，保存液體于-20 ℃冰箱中。重復(fù)此步驟，最終獲得的液體即為濃縮發(fā)酵液。

1.2.2 體外溶解人工血栓效果試驗 將10 mL納豆浸提液倒入裝有制備好的人工血栓培養(yǎng)皿中，蓋上培養(yǎng)皿蓋，在37 ℃條件下孵育數(shù)小時；用10 mL無菌生理鹽水做空白試驗，觀察兩組人工血栓的溶解情況。

1.2.3 血塊溶解率的計算 新鮮雞血在空氣中自然凝固后切成小塊，30 ℃烘干至恒重。每組取血塊2塊，稱重記為m0，分別放入10 mL納豆浸提液、0.9%無菌生理鹽水、納豆激酶濃縮發(fā)酵液和液體培養(yǎng)基中，37 ℃水浴反應(yīng)4 h，每30 min震蕩1次。反應(yīng)結(jié)束后用反應(yīng)液沖洗血塊，30 ℃烘干至恒重，稱量反應(yīng)后血塊質(zhì)量，計算血塊溶解率。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外溶解人工血栓

試驗發(fā)現(xiàn)，浸泡在納豆浸提液中的人工血栓體積明顯減小，而浸泡在生理鹽水中的人工血栓塊體積幾乎無變化，這說明納豆浸提液中確實含有能夠溶解血栓的有效成分，且效果較為顯著。

將濃縮納豆激酶發(fā)酵液倒入裝有人工血栓的Ep管中，37 ℃孵育數(shù)小時，觀察發(fā)現(xiàn)人工血栓幾乎完全溶解。

2.2 體外溶解血塊

不同溶液對雞血塊的溶解效果如表1所示。用多次凍融法得到的濃縮納豆激酶發(fā)酵液的溶血塊效果最為明顯，可達到60%；納豆浸提液的效果次之，可達到52%。這都遠遠大于兩個空白組，說明納豆芽孢桿菌所產(chǎn)的胞外溶解血栓的有效物質(zhì)——納豆激酶具有比較強的溶栓能力。

3 結(jié)論

1） 從體外溶解人工血栓的試驗效果可以看出，納豆浸提液與用多次凍融法提取的納豆激酶發(fā)酵液均可以溶解人工血栓，且納豆激酶發(fā)酵液溶解人工血栓的作用強于納豆浸提液。

2） 從體外溶解血塊的試驗可以得出，納豆激酶發(fā)酵液的溶血塊效果較為明顯，溶解率達到60%；納豆浸提液的溶解率為52%，均遠大于兩個空白組。

3） 試驗結(jié)果顯示，濃縮發(fā)酵液對人工血栓和血塊的溶解效果均大于納豆浸提液，這說明納豆芽孢桿菌產(chǎn)的溶解血栓的有效物質(zhì)——納豆激酶具有比較明顯的溶解血栓能力，且濃度越大效果越強。

參考文獻

[1] SUMI H，HAMADA H，TSUSHIMA H，et al.A novel fibrinolytic enzyme （nattokinase） in the vegetable cheese natto；a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J].Cellular and Molecular Life Sciences，1987，43（10）：1 110-1 111.

[2] FUJITA M，NOMURA K，HONG K， et al.Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme （nattokinase） in the vegetable cheese natto，a popular soybean fermented food in Japan[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，1993，197（3）：1 340-1 347.

[3] 朱健輝，杜連祥，路福平，等.高效溶栓酶——納豆激酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].微生物學(xué)通報，2006，33（1）：68-71.

[4] 王剛，郭明珠，陳光.枯草芽孢桿菌納豆激酶分離純化及酶學(xué)性質(zhì)[J].食品科學(xué)，2012，33（15）：231-234.