高磷對(duì)維持性血液透析透患者微炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激的影響及機(jī)制

陳艷紅，陳 星，成梅初，袁 芳，陳俊香，劉伏友

(1.中南大學(xué) 湘雅二醫(yī)院 腎內(nèi)科, 湖南 長(zhǎng)沙 410011； 2.湖南省人民醫(yī)院 SICU， 湖南 長(zhǎng)沙 410005)

高磷對(duì)維持性血液透析透患者微炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激的影響及機(jī)制

陳艷紅2，陳 星1*，成梅初1，袁 芳1，陳俊香1，劉伏友1

(1.中南大學(xué) 湘雅二醫(yī)院 腎內(nèi)科, 湖南 長(zhǎng)沙 410011； 2.湖南省人民醫(yī)院 SICU， 湖南 長(zhǎng)沙 410005)

目的探討高磷對(duì)維持性血透患者微炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激的影響及機(jī)制。方法實(shí)驗(yàn)分A組(正常人對(duì)照組)，B組(維持性血透患者組即Maintenance hemodialysis，MHD)，C組(不同磷酸二氫鈉濃度劑量組 1.5 mmol/L、 C2 2.5 mmol/L及C3 5.5 mmol/L)，D組(5.5 mmol/L磷酸二氫鈉作用不同時(shí)間組D1 6 h、D2 12 h及D3 24 h)和E組(無(wú)磷酸二氫鈉作用空白組E1 6 h、E2 12 h及E3 24 h組)。用real-time PCR及Western blot分別檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞NF-κB P65及NOX2/gp91的表達(dá)。ELISA檢測(cè)血漿及細(xì)胞培養(yǎng)液上清IL-6含量，硫氮巴比妥酸法檢測(cè)MDA含量。結(jié)果MHD組PBMC中NF-κBP65、NOX2 mRNA及phospho-NF-κBP65、NOX2 蛋白表達(dá)及血漿IL-6、MDA水平明顯高于正常組；磷酸二氫鈉作用下，培養(yǎng)液上清IL-6、MDA產(chǎn)生呈劑量、時(shí)間依賴(lài)性增加(Plt;0.05)。NF-κB P65 mRNA、phospho-NF-κBP65蛋白和NOX2/gp91 mRNAN及蛋白水平表達(dá)呈劑量、時(shí)間依賴(lài)性上調(diào)(Plt;0.05)；NF-κB P65mRNA及phospho-NF-κB P65蛋白表達(dá)與培養(yǎng)液上清IL-6產(chǎn)生呈正相關(guān)， NOX2/gp91mRNA及蛋白表達(dá)與培養(yǎng)液上清MDA產(chǎn)生呈正相關(guān)。結(jié)論高磷可能通過(guò)活化NF-κBP65、NOX2/gp91信號(hào)通路介導(dǎo)炎性介質(zhì)、氧化應(yīng)激產(chǎn)物產(chǎn)生增加，高磷血癥可能為MHD患者微炎性反應(yīng)狀態(tài)和氧化應(yīng)激狀態(tài)的危險(xiǎn)因素。

維持性血液透析；高磷血癥；微炎性反應(yīng)；氧化應(yīng)激

心血管并發(fā)癥是維持性血透(maintenance hemodialysis，MHD)患者首要死亡原因。MHD患者死于心血管疾病 (cardiovascular disease，CVD)約達(dá)50%[1]。大量研究認(rèn)為高磷血癥是導(dǎo)致MHD患者血管鈣化的主要原因[2-4]，是MHD患者并發(fā)心血管病變的關(guān)鍵因素。微炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激狀態(tài)是MHD患者并發(fā)心血管病變的重要因素。MHD患者普遍存在高磷血癥、微炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激狀態(tài)。高血磷在CKD患者炎性反應(yīng)狀態(tài)的發(fā)展中起了重要作用[5]。目前MHD患者高磷血癥與氧化應(yīng)激及微炎性反應(yīng)狀態(tài)的關(guān)系及機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)高磷干預(yù)MHD患者單個(gè)核細(xì)胞，觀察NF-ΚB P65、NADPH亞型(NOX2)的mRNA及蛋白表達(dá)水平及IL-6、MDA的產(chǎn)生變化，初步探討高磷對(duì)炎性介質(zhì)及氧化應(yīng)激產(chǎn)物的影響及其機(jī)制。進(jìn)一步深入認(rèn)識(shí)高磷的危害，為預(yù)防和治療MHD患者高磷所致心血管病變提供新思路。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 入選標(biāo)準(zhǔn)：中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院血液凈化中心MHDA患者(透析6個(gè)月以上)38例(簽署知情同意書(shū))，年齡30～65歲，肝功能、血常規(guī)、血脂正常。透析方案：維持性碳酸氫鹽血液透析治療，每周透析3次，每次4 h，使用貝郎Dialog+血液透析機(jī)，透析液流量500 mL/min，血流量200～300 mL/min，一次性血仿膜透析器(貝郎公司)，血管通路為動(dòng)靜脈內(nèi)瘺。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)穩(wěn)定血液透析lt;6個(gè)月；2)急、慢性肝臟疾病，急、慢性感染，惡性原腫瘤，自身免疫性疾病；3)近3個(gè)月內(nèi)有輸血史或手術(shù)史；4)近1個(gè)月內(nèi)有靜脈補(bǔ)充鈣劑史，使用糖皮質(zhì)激素、鐵劑和降脂藥。體檢正常人20例。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)分組：正常組(A組)：20例；MHD患者組(B組)即：隨機(jī)選取符合入選標(biāo)準(zhǔn)的MHD患者38例MHD患者中20例。余下18例隨機(jī)分成C、D及E組，每組6例。C組：3個(gè)濃度不同磷酸二氫鈉作用組1.5、 2.5和 5.5 mmol/L；D組：5.5 mmol/L磷酸二氫鈉作用6、12和24 h；E組：無(wú)磷酸二氫鈉作用組，常規(guī)培養(yǎng)6、12和24 h。

1.2 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；兔抗人phospho-NF-κB P65 (Ser536)多克隆抗體(CST公司)；兔抗人NOX2/gp91phox多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；鼠抗人β-actin多克隆抗體，辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記抗小鼠二抗、抗兔二抗、抗山羊二抗(中杉金橋公司)；Trizol試劑盒、SYBR green試劑盒(Invitrogen公司)；組織細(xì)胞蛋白裂解液RIPA(北京鼎國(guó)生物公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit)(Fermentas公司)；PCR引物由上海生物工程公司合成；ECL顯影劑、PVDF膜(Millipore公司)。IL-6 ELISA試劑盒(Ramp;D公司)；MDA試劑盒(南京建成)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與干預(yù)

用Ficoll密度梯度法分離MHD患者及正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞及血漿。使用1640+10%胎牛血清培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。首先用1.5、2.5和5.5 mmol/L 3個(gè)不同濃度的磷酸二氫鈉作用MHD患者PBMC 24 h后分離培養(yǎng)液上清及細(xì)胞。接下予高濃度5.5 mmol/L磷酸二氫鈉干預(yù)，作用時(shí)間不同(6、12和24 h)，檢測(cè) PBMC細(xì)胞NF-κB P65及NOX2蛋白及mRNA表達(dá)變化，及培養(yǎng)液上清IL-6、MDA產(chǎn)生變化。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 IL-6的檢測(cè)：收集正常組和MHD血透組患者的血漿及培養(yǎng)液上清，-80 ℃保存，ELISA方法檢測(cè)。

略論財(cái)務(wù)會(huì)計(jì)理論與實(shí)際相結(jié)合創(chuàng)新——高校財(cái)會(huì)教材適應(yīng)發(fā)展更新 ………………………………… 覃正納 劉迎春（1/72）

1.4.2 MDA的檢測(cè)：血清和細(xì)胞上清中的MDA，采用硫代巴比妥酸比色法，嚴(yán)格遵說(shuō)明說(shuō)操作。

1.4.3 Western印跡檢測(cè)PBMC NF-κB P65、NOX2蛋白表達(dá)：將PBMC加入50 μL預(yù)冷的組織細(xì)胞裂解液[使用前加入濃度1/100的苯甲基磺酰氟化物(phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF)]冰上裂解30 min。裂解液4 ℃，12 000r/min離心10 min，上清液移入新的1.5 mL離心管中，用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。按照常規(guī)Western blot方法對(duì)上述各組phospho-NF-κB P65、NOX2及β-actin進(jìn)行檢測(cè)。以所測(cè)得的各條帶的吸光度與內(nèi)參照β-actin吸光度的比值代表定量值。

1.4.4 Real-time PCR檢測(cè)PBMC NF-κB P65、NOX2 mRNA 表達(dá)：按Trizol試劑說(shuō)明書(shū)抽提PBMC總RNA。按標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所得cDNA進(jìn)行real-time PCR實(shí)驗(yàn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組血漿及培養(yǎng)液上清中IL-6和MDA變化

MHD患者血漿IL-6、MDA水平明顯高于正常人(A組)(表1)；C組：磷酸二氫鈉作用于MHD患者PBMC，培養(yǎng)上清IL-6、MDA產(chǎn)生呈劑量依賴(lài)性增加；D組：5.5 mmol/L磷酸二氫鈉作用后培養(yǎng)上清IL-6、MDA產(chǎn)生呈時(shí)間依賴(lài)性增加(表2)。

2.2各組PBMCNF-κBP65、NOX2/gp91mRNA表達(dá)變化

2.2.2 C組中3個(gè)亞組PBMC中NF-κB P65和NOX2/gp91 mRNA表達(dá)水平：不同濃度磷酸二氫鈉作用24 h：NF-κB P65、NOX2/gp91 mRNA表達(dá)呈上調(diào)呈劑量依賴(lài)性上調(diào)(圖2)。

2.2.3 D和E組其各亞組NF-κB P65和NOX2/gp91 mRNA表達(dá)水平：高濃度(5.5 mmol/L)磷酸二氫鈉作用6、12和24 h：NF-κB P65和NOX2/gp91 mRNA表達(dá)水平呈時(shí)間依賴(lài)性增高(圖3)。

表1 正常組與MHD組血漿L-6和MDA變化Table 1 The lever of plasma IL-6 and MDA of different

*Plt;0.05 compared with normal control group.

表2 各組培養(yǎng)液上清中IL-6和MDA變化Table 2 The results of IL-6 and MDA of different

*Plt;0.01 compared with 1.5 mmol/L phosphate concentration group;#Plt;0.01 compared with high phosphate concentration stimulated 6 hours group.

*Plt;0.01 compared with normal control group圖1 MHD患者PBMC中NF-κB P65、NOX2/gp91mRNA表達(dá)情況Fig 1 The NF-κB P65 mRNA and NOX2/gp91 mRNA expression of in PBMCs of MHD patients

*Plt;0.01 compared with 1.5 mmol/L phosphate concentration guoup圖2 不同濃度磷酸二氫鈉干預(yù)NF-κB P65、NOX2/gp91表達(dá)變化Fig 2 The influence of the expression of the NF-κB P65 and NOX2/gp91 mRNA by different of phosphate concentration

*Plt;0.01 compared with high phosphate concentration stimulated 6h group圖3 高濃度磷酸二氫鈉作用不同時(shí)間P65、NOX2/gp91表達(dá)變化Fig 3 The influence of the expression of the NF-κB P65 and NOX2/gp91 mRNA by High phosphate concentration

2.3Phospho-NF-κBP65、NOX2/gp91蛋白含量變化

2.3.1 A和B組PBMC中phospho-NF-κB P65和NOX2/gp91蛋白表達(dá)水平：MHD患者PBMC中phospho-NF-κBP65、NOX2/gp91蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(Plt;0.01)(圖4)。

圖4 MHD患者PBMC中phospho-NF-κBP65、NOX2/gp91 蛋白表達(dá)變化Fig 4 Phospho-NF-κB P65 protein and NOX2/gp91 protein expression of in PBMCs of MHD patients

2.3.2 C組中3亞組PBMC中phospho-NF-κB P65和NOX2/gp91 蛋白表達(dá)水平：不同濃度磷酸氫二鈉鈉作用PBMC 24 h：phospho-NF-κB P65、NOX2/gp91 蛋白表達(dá)呈劑量依賴(lài)性上調(diào)C2、C3與C1組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.01);C3與C2比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.01)(圖5)。

圖5 不同濃度磷酸二氫鈉作用phospho-NF-κB P65、NOX2/gp91蛋白表達(dá)變化Fig 5 The influence of the expression of phospho- NF-κB P65 and NOX2/gp91 protein by different of phosphate concentration

2.3.3 D和E組中各亞組PBMC的phospho-NF-κB P65和NOX2/gp91蛋白表達(dá)水平：高濃度(5.5 mmol/L)磷酸二氫鈉作用不同時(shí)間(6、12和24 h)，phospho-NF-κB P65、NOX2/gp91蛋白表達(dá)呈時(shí)間依耐性上調(diào)D2、D3與D1比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Plt;0.01)，D3與D2比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Plt;0.01)，E組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Pgt;0.05)(圖6)

圖6 高濃度5.5 mmol/L磷酸二氫鈉作用不同時(shí)間phospho-NF-κB P65、NOX2/gp91蛋白表達(dá)變化Fig 6 The influence of the expression of phospho- NF-κB P65 and NOX2/gp91 protein by High phosphate concentration

2.4 相關(guān)指標(biāo)間的相關(guān)性

MHD患者PBMC NF-κB P65 mRNA及phospho-NF-κB P65蛋白表達(dá)與培養(yǎng)液上清IL-6濃度呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.741、r=0.934(Plt;0.01)； NOX2/gp91 mRNA及蛋白表達(dá)與培養(yǎng)液上清MDA濃度呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為：r=0.723，r=0.689(Plt;0.01)。

3 討論

核因子κB(NF-κB)是廣泛表達(dá)的炎性轉(zhuǎn)錄因子。P65通過(guò)蛋白磷酸酶2A去磷酸化后，NF-κB活性降低[6]。因此檢測(cè)磷酸化的P65可以反應(yīng)NF-κB的活化程度。

本研究顯示MHD患者PBMC NF-κB的活性明顯高于健康人，提示MHD患者 NF-κB信號(hào)途徑過(guò)度活化，與其他作者報(bào)道一致[7]。這可能與長(zhǎng)期血液透析、透析膜、透析水純度及體內(nèi)微炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激狀態(tài)相關(guān)。本研究顯示高磷可誘導(dǎo)MHD患者PBMC NF-κB活化，并呈濃度時(shí)間依賴(lài)性，NF-κB P65 mRNA、phospho-NF-κB P65蛋白表達(dá)與培養(yǎng)液上清IL-6濃度呈正相關(guān)。提示高磷可能通過(guò)活化NF-κB信號(hào)通路使IL-6的產(chǎn)生增多。提示MHD患者高磷與微炎性反應(yīng)相關(guān)，高磷可能通過(guò)活化NF-κB促進(jìn)炎性介質(zhì)的產(chǎn)生。

NADPH氧化酶/NOX家族蛋白是生成ROS的重要來(lái)源，并可引起多種心血管疾病[8]。NADPH氧化酶(NOX)在單核細(xì)胞上主要表達(dá)NOX2(gp91phox)，NOX2被認(rèn)為是NADPH氧化酶的催化核心[9]。激活的NOX2，可致氧化應(yīng)激[10]。

本研究顯示MHD患者PBMC的NOX2表達(dá)及血漿MDA水平明顯高于健康人，提示MHD患者處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，與其他作者報(bào)道一致[11]。MHD患者氧化應(yīng)激增強(qiáng)與體內(nèi)某些毒性物質(zhì)蓄積有關(guān)，如晚期氧化蛋白產(chǎn)物，不僅能誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，本身又是氧化應(yīng)激的產(chǎn)物。本研究首次顯示高磷可誘導(dǎo)MHD患者PBMC NOX2 mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)，且培養(yǎng)上清液MDA含量增多，呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性， NOX2/gp91 mRNA及蛋白表達(dá)與培養(yǎng)上清液MDA濃度呈正相關(guān)。提示高磷可能通過(guò)上調(diào) NOX2的表達(dá)，增加MDA產(chǎn)生，加重MHD患者氧化應(yīng)激狀態(tài)。因此高磷可能為MHD患者氧化應(yīng)激增強(qiáng)的一個(gè)重要因素。高磷誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞線(xiàn)粒體勢(shì)能改變?cè)黾覴OS產(chǎn)生[12]，高磷誘導(dǎo)氧化應(yīng)激可能通過(guò)了不同的分子機(jī)制，這點(diǎn)有待進(jìn)一步研究。

總之，本研究一方面提示高磷可誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路活化，促進(jìn)IL-6產(chǎn)生增加，加重MHD患者微炎性反應(yīng)狀態(tài)。另一方面提示高磷可誘導(dǎo)NOX2 mRNA及蛋白的表達(dá)，增加MDA的產(chǎn)生，加重MHD患者氧化應(yīng)激狀態(tài)。高磷可能為MHD患者微炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激狀態(tài)的危險(xiǎn)因素。因此提示可從高磷誘導(dǎo)微炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激角度考慮開(kāi)拓新途徑、新方法以減輕及預(yù)防高磷導(dǎo)致的心血管病變。

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The effect and mechanism of high phosphorus concentration on microinflammatory and oxidative stress response in maintenance hemodialysis patients

CHEN Yan-hong2, CHENG Xing1*, CHENG Mei-chu1, YUAN Fang1, CHEN Jun-xiang1, LIU Fu-you1

(1.Dept. of Nephrology, the Second Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410011；2.Dept. of SICU,Hunan Provincial People’s Hospital, Changsha 410005, China)

ObjectiveTo investigate the effect of high phosphate on mRNA and protein expression of intracellular NF-κB and NOX2/gp91 in PBMC of MHD patients and serum inflammation mediators and MDA production，so as to understand the possible relationship among hyperphosphatemia, micro-inflammatory states and oxidative stress.MethodsThey were divided into five groups: control, MHD, dose, time and blank groups.Western blot and Real-time PCR were respectively used to determine the mRNA and protein expression of NF-κB P65,NOX2.The concentration of IL-6 in the culture supernatant was quantified by the ELISA kit and the TBA assay kit．ResultsNF-κB and NOX2 signal pathway in PBMCs show abnormal activation status in MHD patients. Both expression of NOX2/gp91 mRNA and protein levels increased dose-and time-dependent manners totally. IL-6 and MDA production in supernatant up-regulate dose-and time-dependent manners totally. NF-κB P65 mRNA and phospho-NF-κB 65 protein were positively correlated with IL-6 production. NOX2/gp91 mRNA and protein expression were positively correlated with MDA production.ConclusionsHigh phosphate may increase the production of supernatant IL-6 and MDA by activating NF-κB and NOX2 signaling pathway in PBMCs, thus could be a risk factor for microinflammatory and oxidative stress status of MHD patients.

maintenance hemodialysis; hyperphosphatemia; microinflammatory; oxidative stress

2013-06-04

2013-10-09

*通信作者(correspondingauthor)： c.x1030@163.com

1001-6325(2014)03-0386-05

研究論文

R 692.5

A