人乳頭瘤病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)法

羅永富

(湖南中醫(yī)藥高等專科學(xué)校 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部， 湖南 株洲 412012)

人乳頭瘤病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)法

羅永富*

(湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部， 湖南 株洲 412012)

人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是引起尖銳濕疣甚至癌變的病原體。PCR技術(shù)檢測(cè)病毒DNA序列具有特異、敏感等特點(diǎn)，但對(duì)儀器設(shè)備及檢測(cè)人員技術(shù)要求較高，不適合于基層醫(yī)療單位臨床實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)診斷方法。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)針對(duì)靶基因6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶(BstDNA polymerase)在恒溫條件下完成擴(kuò)增，擴(kuò)增效果可用凝膠電泳、比濁、染色等多種方法檢測(cè)，具有反應(yīng)時(shí)間短、肉眼可判斷結(jié)果和不需要PCR儀等優(yōu)點(diǎn)。國內(nèi)外利用LAMP技術(shù)檢測(cè)HPV的方法研究偶有報(bào)道[1-2]，但針對(duì)HPV-6和HPV-11成功的方法研究未見文獻(xiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床標(biāo)本來源：10例標(biāo)本均取自邵陽醫(yī)專附屬醫(yī)院基因診斷室。在告知患者并征得同意的情況下由門診醫(yī)生用棉拭子在患者外陰部疑似病灶部位涂抹，置于裝有1 mL無菌0.9%氯化鈉注射液的試管中送檢。其中6例經(jīng)熒光PCR驗(yàn)證為HPV病毒陽性臨床標(biāo)本；2例沙眼衣原體陽性標(biāo)本和2例解脲支原體陽性標(biāo)本作為LAMP檢測(cè)HPV病毒的陰性對(duì)照。

1.1.2 試劑：限制性內(nèi)切酶(Promega公司)；Betaine(Fluka公司)；Bst DNA Polymerase(Biolabs 公司)；100 bp DNA Ladder(BioDev公司)；DNA Maker Ⅰ(天根公司)；dNTP 和Taq plus DNA聚合酶(北京鼎國公司)；病毒DNA提取試劑盒(四川天澤公司)；MgSO4(Sigma公司)；SYBR Green Ⅰ(北京天恩澤基因科技有限公司)；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 引物：選取HPV-6E6基因(基因序號(hào)：AF092932)的174～381 bp序列和HPV-11E6基因(基因序號(hào)：M14119)的129～306 bp區(qū)域序列，用專用引物軟件(Primer Explorer V4)分別設(shè)計(jì)HPV-6與HPV-11正向外引物(F3)、反向外引物(B3)、正向內(nèi)引物(FIP)和反向內(nèi)引物(BIP)4條，引物由廣州英駿公司合成。用BLAST軟件進(jìn)行互補(bǔ)分析，HPV-6的4條引物不與HPV-11E6 DNA序列互補(bǔ)；HPV-11的4條引物不與HPV-6E6 DNA序列互補(bǔ)。

1.2 方法

1.2.1 樣本處理與DNA提取液的制備:將10例送檢標(biāo)本充分振蕩懸浮，擠干棉拭子中的水分，棄棉拭子，15 000 r/ min離心5 min，棄上清液，留沉淀，加600 μL病毒DNA提取液充分混勻，加700 μL異丙醇，振蕩混勻，12 000 r/ min離心1 min，棄上清液，沉淀用75%乙醇洗滌2次，12 000 r/min離心1 min，棄上清液，將離心管倒置于濾紙上10～15 min，待酒精揮發(fā)干凈后加入100 μL TE溶液4 ℃過夜充分溶解DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP):取兩組反應(yīng)杯，每組10只，標(biāo)以①～⑩的標(biāo)號(hào)，其中①～⑥為PCR確定的臨床HPV陽性標(biāo)本，⑦～⑩為4例陰性對(duì)照標(biāo)本。每只反應(yīng)杯對(duì)應(yīng)加入DNA提取液2.0 μL，第一組加入HPV-6的4條引物，第二組加入HPV-11的4條引物，加入其他試劑。置于65 ℃孵育60 min。然后置于80 ℃ 2 min滅活酶，終止擴(kuò)增。

1.2.3 電泳與結(jié)果判斷:取1 μL擴(kuò)增液與0.2 μL上樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣于含0.8 μg/mL溴化乙錠的2%～3 %瓊脂糖凝膠中，70 V電泳約60～100 min后置于凝膠成像系統(tǒng)中成像，電泳圖片顯示LAMP特征性梯狀區(qū)帶，則判為陽性結(jié)果；如無任何區(qū)帶則結(jié)果為陰性。

1.2.4 酶切鑒定:取經(jīng)電泳確定HPV-6陽性的擴(kuò)增液和HPV-11陽性擴(kuò)增液分別進(jìn)行酶切分析，以位于HPV-6E6基因251～254 bp區(qū)域的AluI和位于HPV-11E6基因156～159 bp區(qū)域的TaiI作為酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切反應(yīng)。而后取2.5 μL酶切液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.5 染色反應(yīng)與結(jié)果判斷:向每只反應(yīng)杯里剩余的擴(kuò)增液中加入熒光染料SYBR Green Ⅰ 1.0 μL，混勻，置紫外燈下觀察結(jié)果。反應(yīng)混合物變綠為陽性；保持 SYBR Green Ⅰ的橙色不變?yōu)殛幮浴?/p>

1.2.6 LAMP敏感性分析:260 nm測(cè)定HPV DNA提取液的DNA濃度，調(diào)整濃度為1.0×104mg/L，10倍系列稀釋為10×10-1～10×10-6mg/L 6個(gè)濃度，分別用LAMP和PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 電泳結(jié)果:用HPV-6LAMP引物檢測(cè)6例HPV-6/HPV-11陽性臨床標(biāo)本，臨床標(biāo)本①，②，③，④和⑤出現(xiàn)LAMP梯狀區(qū)帶(圖1)；用HPV-11 LAMP引物檢測(cè)6例PV-6/HPV-11陽性臨床標(biāo)本①，②，⑤和⑥出現(xiàn)LAMP梯狀區(qū)帶(圖2)。4例陰性對(duì)照標(biāo)本均未見任何區(qū)帶。

1.100 bp DNA marker; 2～7.HPV-6/11 positive samples ①, ②, ③, ④, ⑤, ⑥; 8.negative control圖1 HPV-6 LAMP引物擴(kuò)增HPV6/11電泳圖Fig 1 The specificity of HPV-6 LAMP primer-amplified HPV-6/11 electrophoretogram

1.100b p DNA marker; 2～7.HPV-6/11 positive samples ①, ②, ③, ④, ⑤, ⑥; 8.negative control圖2 HPV-11 LAMP引物擴(kuò)增HPV6/11電泳圖Fig 2 The specificity of HPV-11 LAMP primer-amplified HPV-6/11 electrophoretogram

2.2 酶切結(jié)果:取HPV-6 LAMP液④和HPV-11 LAMP液⑥分別進(jìn)行酶切分析，AluI酶切片段有：139、70、118和11 bp。TaiI酶切片段有：196、160、144和25 bp。

2.3 染色結(jié)果:6例HPV陽性標(biāo)本擴(kuò)增液均顯綠色，為陽性。4個(gè)對(duì)照標(biāo)本擴(kuò)增液均無顏色變化，為陰性。

2.4 LAMP敏感性分析結(jié)果:LAMP和PCR檢測(cè)HPV-6、HPV-11的敏感性均為10×10-6mg/L。

3 討論

尖銳濕疣在歐美國家已居性傳播疾病的首位，在我國居第2位，成為人們關(guān)注的社會(huì)公共問題之一。因此，HPV DNA的檢測(cè)對(duì)流行病學(xué)的調(diào)查和公共健康問題具有重要的價(jià)值。目前HPV的檢測(cè)幾乎依賴于分子生物學(xué)方法檢測(cè)其基因, PCR法比較費(fèi)時(shí)且需要特殊的儀器，因此在臨床推廣應(yīng)用上受到限制[3]。本研究收集了6例經(jīng)熒光PCR鑒定過的HPV陽性臨床標(biāo)本，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該6例HPV陽性標(biāo)本中檢測(cè)出標(biāo)本③和④僅HPV-6陽性，標(biāo)本⑥僅HPV-11陽性，此外，標(biāo)本①，②和⑤為HPV-6和HPV-11雙陽性。表明此3例存在HPV-6和HPV-11兩型病毒同時(shí)感染。取HPV-6 LAMP產(chǎn)物④和HPV-11 LAMP產(chǎn)物⑥分別進(jìn)行酶切鑒定，酶切電泳結(jié)果與理論預(yù)計(jì)相符。染色反應(yīng)顯示6例HPV陽性標(biāo)本均為陽性，4例對(duì)照標(biāo)本均為陰性。敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LAMP檢測(cè)HPV-6和HPV-11DNA的最低濃度可達(dá)10×10-6mg/L水平，其敏感性與PCR相當(dāng)。以上結(jié)果顯示該法不僅可區(qū)別HPV型別，而且具有較高的特異性與敏感性，可作為HPV的快速檢測(cè)方法推廣應(yīng)用。

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2013-02-06

2013-05-02

2011年度湖南省普通高校科學(xué)研究課題(11C0975)

*通信作者(correspondingauthor)： lyf155@263.net

1001-6325(2014)01-0113-02

Q 939.4

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