食欲素A促人胃癌SGC7901細胞凋亡

高之峰，張建福，費素娟，汪詩卉，董秋菊，韓紅霞

(徐州醫(yī)學院 1.附屬醫(yī)院 消化內科；2.生理學教研室， 江蘇 徐州 221002)

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研究論文

食欲素A促人胃癌SGC7901細胞凋亡

高之峰1#，張建福2#，費素娟1*，汪詩卉1，董秋菊1，韓紅霞1

(徐州醫(yī)學院 1.附屬醫(yī)院 消化內科；2.生理學教研室， 江蘇 徐州 221002)

目的觀察食欲素A對胃癌SGC7901細胞生長的影響，并初步探討其機制。方法常規(guī)培養(yǎng)胃癌SGC7901細胞，單獨食欲素A處理及食欲素A受體拮抗劑SB408124干預后再用食欲素A作用，MTT法檢測藥物對SGC7901細胞抑制率；Hoechst33258熒光染色法及流式細胞術檢測細胞凋亡；Western blot方法檢測BCL-2、BAX、Cyt c和活化caspase-3蛋白的表達。結果食欲素A呈劑量-時間依賴性的抑制胃癌SGC7901細胞增殖，其中1.0 μmol/L 食欲素A作用24h對胃癌細胞增殖的抑制作用最強，抑制率為65.32%±2.51%(Plt;0.01)；食欲素A組可見較多凋亡細胞：胞核或胞質內可見濃染致密的藍色熒光，有明顯的核固縮，SB408124干預后，凋亡細胞數量明顯減少(Plt;0.05)；食欲素A作用后，凋亡率為59.52%±1.38%，而SB408124干預后，凋亡率降至38.96%±1.82%(Plt;0.05)；食欲素A可上調凋亡相關蛋白BAX、Cyt c及活化caspase-3的表達，下調抗凋亡蛋白BCL-2的表達(Plt;0.05)，SB408124干預后，食欲素A作用減弱。結論食欲素A對胃癌SGC7901細胞生長具有明顯的抑制增殖和促凋亡作用；食欲素A的作用是通過其選擇性受體實現的。

食欲素A；SGC7901細胞；SB408124；凋亡

食欲素(orexin)是下丘腦區(qū)發(fā)現的一類神經肽[1]，包括食欲素A(orexin A, OA)和食欲素B(orexin B)。Orexin的基本功能是調節(jié)食欲、睡眠-覺醒周期、能量平衡、心血管和內分泌等[2]。近年來，國外有文獻報道，orexin對離體培養(yǎng)的結腸癌細胞、神經母細胞瘤細胞等有促凋亡作用。

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，晚期治療主要為化療為主的綜合治療，而化療藥物的諸多不良反應限制了治療效果，因此選擇在化療過程中對腫瘤細胞最大限度的殺傷，而對正常細胞毒性最低的藥物越來越引起重視。是否orexin對胃癌細胞同樣有殺傷作用從而用于胃癌的治療，降低化療的不良反應，目前國內尚無此方面研究報道，本實驗以orexin A為研究對象，觀察其對胃癌SGC7901細胞生長的影響，并初步探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

胃癌SGC7901細胞系(北京腫瘤研究所)；orexin A、orexin-1受體選擇性拮抗劑(SB408124，SB)和Hoechst33258(Sigma公司)；Avnnexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物發(fā)展有限公司)；鼠抗BCL-2單克隆抗體、鼠抗BAX單克隆抗體、堿磷酶標記馬抗小鼠IgG抗體、堿磷酶標記馬抗小鼠β-actin和小鼠抗β-actin單克隆抗體(北京中杉生物技術有限公司)；細胞色素c小鼠單克隆抗體、堿磷酶標記的羊抗兔抗體和抗caspase-3 (激活型)兔單克隆抗體(碧云天生物技術研究所)；四甲基偶氮唑藍(MTT)(Amresco公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組：SGC7901細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2和相對濕度95%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液，每3～4天傳代1次，實驗時選用對數增殖期細胞。實驗分為正常對照組(N組，即正常培養(yǎng)的胃癌細胞)、溶劑對照組(0.3% 二甲亞砜-DMSO)、orexin A組(0.01、0.1和1.0 μmol/L)、SB408124+ orexin A組(10 μmol/L SB408124預處理，1 h后加1.0 μmol/L orexin A)。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖抑制率：取SGC7901細胞5×104/mL接種于96孔板培養(yǎng)，待細胞貼壁后，按實驗分組，分別培養(yǎng)6、12和24 h后，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL。4 h后，吸盡各孔培養(yǎng)液，每孔加DMSO 200 μL，輕輕震蕩10 min后，用酶標儀檢測490 nm處各孔吸光度A值，計算細胞抑制率。細胞抑制率(%)=(1-實驗組各孔平均A值/正常對照組各孔平均A值)×100%，實驗重復3次。

1.2.3 Hoechst33258熒光染色法觀察凋亡細胞的形態(tài)學變化：細胞接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)。按分組實驗后，吸盡培養(yǎng)液，加入0.5 mL 40g /L的多聚甲醛液固定細胞10 min；去固定液，用0.01 mol/L的PBS洗2次，洗滌時用手輕輕晃動，吸盡液體；加入0.5 mL Hoechst 33258染色液，37 ℃染色15 min；去染色液，用PBS洗2次；熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長為350 nm，發(fā)射波長為460 nm，細胞核呈致密濃染或呈碎塊狀致密濃染為凋亡陽性細胞，計數并拍照保存。

1.2.3 流式細胞技術檢測細胞凋亡率：取對數增殖期細胞以每孔1×105個/mL的細胞濃度接種于6孔板，每孔2 mL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)過夜，待細胞貼壁后，按實驗分組藥物作用24 h后，收集細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后離心，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用PBS洗滌2次后，將細胞重懸于500 μL結合緩沖液中，加入20 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶(PI)中，輕輕混勻，室溫避光5 min，用流式細胞儀檢測。

1.2.4 Western blot法檢測凋亡蛋白 BAX、BCL-2、Cyt c和活化caspase-3的表達：收集不同處理組的SGC7901細胞，加入蛋白裂解液，提取蛋白，進行蛋白定量，取蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，半干轉至硝酸纖維膜上，加入BCL-2、BAX、Cyt c和caspase-3抗體，4 ℃冰箱過夜孵育后洗滌，加入二抗，室溫孵育2 h，用緩沖液洗滌(配制：Tris 1.21 g,NaCl 5.84 g，Tween-20 1 mL，加雙蒸水定容至1 000 mL，調pH至7.5)，洗滌后BCIP/NBT法顯色，檢測細胞中相關蛋白的表達。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 不同濃度orexin A對SGC7901細胞增殖的抑制作用

3種劑量的orexin A分別處理6、12和24 h后，SGC7901細胞呈現出時間-濃度依賴性增殖抑制；其中1.0 μmol/L orexin A作用24 h對SGC7901細胞抑制作用最強(Plt;0.01)，故在以后的實驗中orexin A均采用1.0 μmol/L作用24 h(圖1)。

（29）妙用之因，神明之契，必有奧旨，願釋鄙懹。（《太上說玄天大聖真武本傳神呪妙經註》卷三，《中華道藏》30/554）

*Plt;0.01 compared with DMSO group圖1 不同濃度orexin A分別作用6、12和24 h對SGC7901細胞的抑制作用Fig 1 Inhibitory effect of orexin A with different con- centrations in different times on viability of

2.2 Orexin A及SB408124對SGC7901細胞抑制率的影響

Orexin A處理后，細胞抑制率顯著提高，經SB408124干預，細胞抑制率回降(Plt;0.01)，但仍高于對照組(Plt;0.05)(圖2)。

2.3 熒光染色觀察orexin A及SB408124對胃癌細胞形態(tài)及凋亡率的變化

鏡下orexin A組可見較為典型的凋亡形態(tài)學變化：胞核皺縮，熒光強度增強，凋亡小體形成等，凋亡細胞增多；而SB408124干預后，同樣可見典型的凋亡細胞及形態(tài)學變化但凋亡細胞數量減少(Plt;0.05)(圖3)。

*Plt;0.05 compared with DMSO group； #Plt;0.05 compared with orexin A group and DMSO group圖2 單獨orexin A及SB408124干預分別作用對SGC7901細胞的抑制作用Fig 2 Inhibitory effect of orexin A and pretreatment with SB408124 on viability of SGC7901 cell

2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率

Orexin A組，細胞凋亡率明顯增高(Plt;0.05)，經SB408124干預，凋亡率回降，仍高于對照組(Plt;0.05)(圖4)

2.5 Orexin A及SB408124對胃癌SGC7901細胞蛋白BCL-2、BAX、活化caspase-3表達的影響

Orexin A處理后，BAX、Cyt c和活化caspase-3蛋白表達上調，BCL-2蛋白表達顯著減少(Plt;0.05)。SB408124干預后，BAX、Cyt c和活化caspase-3蛋白表達下調，BCL-2蛋白表達增加(Plt;0.05)(圖5)。

3 討論

國外文獻報道食欲素對結腸癌細胞、神經母細胞瘤細胞等有抑增殖促凋亡作用[3]。本實驗結果顯示，orexin A能呈劑量-時間依賴性的抑制SGC7901細胞的增殖，orexin A作用于SGC7901后凋亡率明顯增高。表明orexin A對胃癌SGC7901細胞同樣具有抑增殖促凋亡作用。

細胞對死亡信號的敏感性取決于胞內BCL-2/BAX競爭性的二聚體化過程，隨BCL-2蛋白表達量的下降，有利于BAX二聚體形成，細胞發(fā)生凋亡[4-6]。

*Plt;0.05 compared with DMSO group； #Plt;0.05 compared with orexin A group圖3 單獨orexin A及SB408124干預分別作用24 h對SGC7901細胞凋亡的影響Fig 3 Effect of orexin A and pretreatment with SB408124 on cell apoptosis in SGC7901 cell (±s,%, n=5)

A.N; B.DMSO; C.OA; D.SB+OA;*Plt;0.05 compared with control group； #Plt;0.05 compared with orexin A group圖4 單獨orexin A及SB408124干預分別作用對SGC7901細胞凋亡率的影響Fig 4 Effect of orexin A and pretreatment with SB408124 on cell apoptosis in SGC7901 cell(±s, %, n=3)

Orexin有orexin-1受體(OX1R)和orexin-2受體(OX2R)二種亞型，SB408124是OX1R的選擇性拮抗劑[9-10]，orexin A作用于結腸癌細胞HT29-D4膜上的OX1R，誘導Cyt c釋放，激活線粒體/細胞色素c介導的細胞凋亡，從而引發(fā)了orexin 對結腸癌細胞的促凋亡作用[11]。 本實驗采用了單獨orexinA作用及SB408124干預后再用orexin A作用對比來觀察兩種處理方法對細胞的影響。結果顯示：與單獨orexin A作用比較，SB408124干預后，細胞抑制率、凋亡率均明顯下降；Cyt c及活化caspase-3蛋白的表達量也較單獨orexin A組下降。上述實驗結果提示本實驗中orexin A對胃癌細胞的作用是通過OX1R實現的。

*Plt;0.05 compared with control group；#Plt;0.05 compared with orexin A group圖5 單獨orexin A及SB408124干預分別作用對SGC7901細胞BCL-2、BAX、Cyt c及活化caspase-3蛋白表達的影響

綜上所述，本實驗研究顯示orexin A對胃癌SGC7901細胞有明顯的抑制增殖和促凋亡的作用，而orexin A誘導胃癌細胞凋亡的作用是通過其選擇性受體實現的，盡管具體的分子機制有待進一步研究探索，但此研究結果也進一步補充了orexin 的生物學功能，這也為腫瘤的預防、治療起到一定的指導作用。

[1] Takeshi S, Akira A, Makoto I,etal. Orexins and orexin receptors: a family of hypothalamic neuropeptides and G protein-coupled receptors that regulate feeding behavior[J]. Cell, 1998, 92: 573-585.

[2] 閆潔, 胡志安. Orexin與胃腸活動的調節(jié)[J]. 生理科學進展, 2005, 36: 185-188.

[3] Patricia RB, Christiane RF, Anne J,etal. Orexins acting at native OX(1) receptor in colon cancer and neuroblastoma cells or at recombinant OX(1) receptor suppress cell growth by inducing apoptosis[J]. J Biol Chem, 2004, 279: 45875-45886.

[4] Ofengeim D, Chen YB, Miyawaki T,etal. N-terminally cleaved Bcl-xL mediates ischemia-induced neuronal death[J]. Nat Neurosci, 2012, 15: 574-580.

[5] 梁梓宇, 姜海行, 覃山羽, 等. 大鼠骨髓間充質干細胞體外誘導肝星狀細胞系凋亡[J]. 基礎醫(yī)學與臨床, 2010, 30: 836-842.

[6] Maaser K, Sutter AP, Scher AA,etal. Mechanisms of mitochondrial apoptosis induced by peripheral benzodiazepine receptor ligands in human colorectal cancer cells[J]. Biochem Biophys Res Communi, 2005, 332: 646-652.

[7] 常青, 王曉良. 細胞色素C、線粒體與凋亡. 中國藥理學通報[J], 2003, 19: 241-244.

[8] 葉記林, 劉延慶, 劉永春, 等. TRAIL誘導Hela細胞凋亡的線粒體信號通路[J]. 基礎醫(yī)學與臨床, 2011,31: 1120-1123.

[9] Thierry V, Aadil EF, Christiane RF,etal. A hallmark of immunoreceptor, the tyrosine-based inhibitory motif ITIM, is present in the G protein-coupled receptor OX1R for orexins and drives apoptosis: a novel mechanism[J]. FASEBJ, 2008, 22: 1993-2002.

[10] Agata W, Kaja B, Anna W,etal. Activation of orexin/hypocretin type 1 receptors stimulates cAMP synthesis in primary cultures of rat astrocytes[J]. Pharm Reports, 2011, 63: 717-723.

[11] Aadil EF, Thierry V, Christiane RF,etal. Discovery of a functional immunoreceptor tyrosine-based switch motif in a 7-transmembrane-spanning receptor: role in the orexin receptor OX1R-driven apoptosis[J]. FASEB J, 2009, 23: 4069-4080.

Orexin A promotes the apoptosis of human gastric cancer cell SGC7901

GAO Zhi-feng1#, ZHANG Jian-fu2#, FEI Su-juan1*, WANG Shi-hui1, DONG Qiu-ju1, HAN Hong-xia1

(1.Dept of Gastroenterology, the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College;2.Dept. of Physiology, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, China)

ObjectiveTo explore the effect of orexin A on the growth of human gastric cancer cell line SGC7901 and its mechanisms.MethodsThe SGC7901 cells were treated by orexin A and SB408124 (an antagonist of orexin A receptor subtype 1). The MTT assay was used to detect growth inhibitory rates of orexin A on human gastric cell SGC7901. The apoptosis was determined by Hoechst 33258 fluorochrome staining and flow cytometric analysis; and we used Western blot to detect the expressions of BCL-2 BAX Cyt c and caspase-3.ResultsOrexin A can inhibit the growth of SGC7901 cells. This can be proved by a direct relationship between a longer time for cells to culture when given a higher dose of orexin A. The strongest inhibitory rate was 65.32%±2.51%, when we used 1.0 μmol/L orexin A treat for 24 h(Plt;0.01); we can see many apoptotic cells that the nuclear condensation in orexin A group，While cells that were pretreated with SB408124 showed the number of the native cell was decreased (Plt;0.05). After treated with orexin A, the apoptosis rate was 59.52%±1.38%， but when we pretreated with SB408124, the apoptosis rate decrease to 38.96%±1.82%；the expressions of BAX Cyt c and caspase-3 protein were increased, but the expression of BCL-2 was decreased(Plt;0.05). As mentioned above, the inhibitory effects of orexin A on SGC7901 cell were weakened by the pretreatment with SB408124.ConclusionsOrexin A significantly inhibits the growth of SGC7901 cells through inducing cell apoptosis. Its molecular mechanism is associated with OX1R.

orexin A; SGC7901 cell; SB408124; apoptosis

2013-04-07

2013-06-24

*通信作者(correspondingauthor)： xhbyjs@xzmc.edu.cn

1001-6325(2014)01-0098-06

R 735.2

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