重組結(jié)核病疫苗rBCG-IL-12p70-TB10.4的免疫效應(yīng)

張豐經(jīng)，何紅云，鄧儀昊，楊開明

(云南省大理學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 人體解剖學(xué)教研室，云南 大理 671000)

研究論文

重組結(jié)核病疫苗rBCG-IL-12p70-TB10.4的免疫效應(yīng)

張豐經(jīng)，何紅云，鄧儀昊*，楊開明

(云南省大理學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 人體解剖學(xué)教研室，云南 大理 671000)

目的將成功構(gòu)建的重組卡介苗rBCG-IL-12p70-TB10.4免疫BALB/c小鼠，研究其免疫效應(yīng)，為結(jié)核病新疫苗的研發(fā)提供依據(jù)。方法將融合基因IL-12p70-TB10.4克隆入pMV361構(gòu)建重組質(zhì)粒，以電轉(zhuǎn)化方式將重組質(zhì)粒導(dǎo)入卡介苗基因組，構(gòu)建重組結(jié)核病疫苗rBCG-12p70-TB10.4 (rBCG-IT)。將此重組卡介苗免疫BALB/c小鼠，分別于免疫后3、6、9和12周，用間接ELISA檢測(cè)特異性抗體滴度水平，XTT檢測(cè)脾細(xì)胞增值反應(yīng), 流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾CD4+T、CD8+T細(xì)胞亞型的比例，ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞因子的誘生。結(jié)果在免疫后3～12周，rBCG-IT組脾細(xì)胞增殖反應(yīng)均明顯強(qiáng)于其他各組(Plt;0.01)，該組IFN-γ誘生量及CD4+T細(xì)胞比例均顯著高于rBCG-I組、rBCG-T組及BCG組(Plt;0.01)。IgG2a/IgG1比值在免疫后各時(shí)間點(diǎn)的變化趨勢(shì)提示rBCG-IT可誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答。結(jié)論重組疫苗rBCG-IT可誘導(dǎo)產(chǎn)生較BCG更強(qiáng)、持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，可對(duì)其免疫保護(hù)作用進(jìn)行深入研究。

重組卡介苗；IL-12p70；TB10.4；免疫效應(yīng)

由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染引起的結(jié)核病仍是嚴(yán)重威脅人類健康的重大傳染病。目前，預(yù)防結(jié)核病的唯一有效疫苗是卡介苗(bacilli calmette-guérin, BCG)，而BCG的免疫保護(hù)作用在某些人群或地區(qū)不穩(wěn)定[1]。在各國(guó)學(xué)者的努力下，有多種新型MTB疫苗相繼問世，有數(shù)株疫苗甚至已進(jìn)入臨床前期研究[2-3]。但到目前為止，還沒有一種新型結(jié)核病疫苗可取代BCG在人類推廣使用。

TB10.4只存在于致病性結(jié)核分枝桿菌H37Rv[4]。由于TB10.4具有較強(qiáng)的免疫原性，已被廣泛應(yīng)用于多種新型結(jié)核病疫苗的研究[5-6]。目前全球有約1/3人群感染MTB，其中90%為潛伏感染者[7]。若要發(fā)展針對(duì)潛伏感染菌的疫苗，則要求該疫苗不僅具有較強(qiáng)的免疫刺激作用，還應(yīng)具備刺激機(jī)體產(chǎn)生多種細(xì)胞因子的功能。Interleukin(IL)-12是體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)作用最強(qiáng)、調(diào)節(jié)范圍最廣的細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)多功能免疫細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子如IL-2、IFN-γ及TNF-α等[8]。因此，在本研究中，向BCG基因組引入免疫刺激性抗原TB10.4的同時(shí)，向其導(dǎo)入具有調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子產(chǎn)生的IL-12p70構(gòu)建新型結(jié)核病疫苗，以期獲取更理想的、尤其是針對(duì)休眠期MTB的結(jié)核病新疫苗。

1 材料與方法

1.1 材料

含大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒pMV361的菌液及結(jié)核分枝桿菌H37RV基因組DNA(本室保存)。含人細(xì)胞因子IL-12p70基因的質(zhì)粒pORF-IL-12p70 G2(InvivoGen公司)；BCG上海株(成都生物制品研究所)。高保真Taq DNA聚合酶、質(zhì)粒提取試劑盒和DNA連接試劑盒(Omega公司)。限制性核酸內(nèi)切酶(晶美生物公司)。結(jié)核菌素純蛋白衍生物 (1 mg/L, TB-PPD，北京祥瑞生物制品有限公司)；抗結(jié)核分枝桿菌TB10.4及抗人IL-12p40單克隆抗體(Abcam公司)；PE 標(biāo)記的CD4+及FITC標(biāo)記的CD8+IgG(eBioscience 公司)；IFN-γ及IL-4檢測(cè)試劑盒(Bamp;D公司)。

1.2 方法

1.2.1 重組疫苗rBCG-IT的構(gòu)建及鑒定：根據(jù)人細(xì)胞因子IL-12p70及TB10.4基因序列設(shè)計(jì)并合成下述3對(duì)引物：P1：5′-GCCAATTGATATGTGTCACAGC AGTTG-3′(MunI)；P2：5′-GCTTCGAATGGAAGCATT CAGATAGCT-3′(NspV)；P3：5′-GCCAATTGTAATGT CGCAAATCATGTACAAC-3′(MunI)；P4：5′-ATTTCG AATCTAGCCGCCCCATTTGG-3′(MunI)；P5：5′-GCT TCCACCTCCTCCGCTTCCACCACCTCCGCTTCCACCG CCACCGGAAGCATTCAGATAGCT-3′(Linker)；P6：5′-GGTGGCGGTGGAAGCGGAGGTGGTGGAAGCGGA GGAGGTGGAAGCAATGTCGCAAATCATGTACAAC-3′(Linker)。短劃線部分為克隆位點(diǎn)，長(zhǎng)劃線部分為45bp互補(bǔ)linker堿基序列。以pORF-IL-12p70 G2為模板，P1和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲取IL-12-p70，以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組DNA為模板，P3和P4為引物獲取TB10.4基因，分別在IL-12-p70上游引物(P5)及TB10.4下游引物(P6)分別引入45bp互補(bǔ)linker堿基序列，通過重疊延伸PCR(spliced overlap extension PCR, SOE PCR)獲取融合基因IL-12-p70-TB10.4。將上述基因分別克隆入以大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒pMV361構(gòu)建重組質(zhì)粒。向BCG菌苗加入終濃度為5%甘氨酸，37 ℃作用24 h，集菌，10%甘油洗滌，再重懸于10%甘油制備BCG感受態(tài)細(xì)胞，將上述重組質(zhì)粒及pMV361空質(zhì)粒加入感受態(tài)BCG，電穿孔儀(BTX)進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)化結(jié)束后，將菌懸液轉(zhuǎn)入含卡拉霉素的Sauton培養(yǎng)基進(jìn)行抗生素篩選、提取重組卡介苗基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增及基因測(cè)序鑒定，對(duì)重組卡介苗進(jìn)行熱誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)Western blot鑒定，重組卡介苗表達(dá)相應(yīng)重組蛋白后分別命名為： rBCG-I(rBCG-IL-12p70)，rBCG-T(rBCG-TB10.4)，rBCG-IT(rBCG-IL-12p70-TB10.4)，rBCG-361。

1.2.2 動(dòng)物分組及免疫：清潔級(jí)、雌性BALB/c小鼠，3～5周齡，96只(昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK 滇2005-0008)，隨機(jī)分為6組：即BCG組；rBCG-I組；rBCG-T組；rBCG-IT組；rBCG-361組；對(duì)照組：PBST組(0.01 mol/L PBS中含0.05% 吐溫80)，每組16只。重組卡介苗及BCG以5×105CFU稀釋于PBST液(0 .1 mL)，皮下多點(diǎn)注射免疫，PBST組注射等體積PBST。

1.2.3 特異性血清IgG、IgG1及IgG2a抗體滴度檢測(cè)：分別于免疫后3、6、9及12周，每組取4只小鼠，活體摘眼球取血，離心收集血清備用。用間接ELISA(indirect enzyme-linked immunosorbent assay, iELISA)測(cè)定血清抗體滴度。TB-PPD(1 mg/L,100 μL)包被酶標(biāo)板，4 ℃避光放置12 h，將待測(cè)血清2倍系列稀釋加入酶標(biāo)板，37 ℃孵育1 h，PBST(0.01 mol/L PBS中含0.05% 吐溫20)洗板3次，分別加入適當(dāng)稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(稀釋度為1∶4 000)、IgG1(稀釋度為1∶1 000)或IgG2a(稀釋度為1∶1 000)，37 ℃溫育45 min，洗板后OPD顯色，490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值(A值)。以PBST組為陰性對(duì)照。當(dāng)A490值≥0.05、實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值≥2.0認(rèn)定為陽性?？贵w滴度定義為血清樣品吸光度值/陰性對(duì)照組(PBST)吸光度值≥2.0時(shí)的最大血清稀釋倍數(shù)。每個(gè)血清樣本進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算IgG2a/ IgG1值，觀察疫苗誘導(dǎo)的免疫趨向。

1.2.4 特異性脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(XTT)：無菌條件下分離脾臟，經(jīng)研磨、過濾和吹打制成單細(xì)胞，置含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。調(diào)整細(xì)胞數(shù)，加入96孔板，每孔5×104/0.1 mL，每個(gè)樣本設(shè)6個(gè)復(fù)孔，并設(shè)非刺激孔和空白對(duì)照孔，刺激孔加入等體積TB-PPD(1 mg/L)進(jìn)行刺激，非刺激孔加入等量PBS，空白對(duì)照孔不加淋巴細(xì)胞，以等體積PBS代替。37 ℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)72 h，結(jié)束培養(yǎng)前4 h加入XTT混合液(1 g/L的XTT 4 mL中含0.15 g/L的PMS 0.1 mL)20 μL，450 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度(A450)，結(jié)果用刺激指數(shù)SI表示，SI=刺激孔吸光度值/非刺激孔吸光度值。每組細(xì)胞進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 脾CD4+T和CD8+T細(xì)胞亞型的比例變化：分別在免疫后3、6、9及12周，將上述分離培養(yǎng)細(xì)胞以每孔3×106/1 mL加入6孔板，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)加入等體積TB-PPD(1 g/L)進(jìn)行刺激，37 ℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌后，分別加入PE標(biāo)記的羊抗小鼠CD4+IgG(0.01 mol/L PBS稀釋，稀釋度為：1∶200)及FITC標(biāo)記的羊抗小鼠CD8+IgG(1∶150)，室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+T和CD8+T細(xì)胞的比例。

1.2.6 細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4的誘生：將上述脾細(xì)胞加入6孔板，每孔2×106/1 mL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，等體積TB-PPD(1 g/L)刺激72 h，收集培養(yǎng)液，IFN-γ或IL-4檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞因子的表達(dá)，各操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒操作指南進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 重組疫苗的構(gòu)建及鑒定

各重組疫苗均構(gòu)建成功。重組疫苗rBCG-IT可表達(dá)相應(yīng)目的蛋白(圖1)，而BCG及rBCG-361均不能表達(dá)IL-12p70及TB10.4.

A.expression of rBCG-IT was detected with antibody recognizing IL-12p70; B.expression of rBCG-IT was detected with antibody recognizing TB10.4 圖1 重組卡介苗rBCG-IT熱誘導(dǎo)表達(dá)及Westernblot鑒定Fig 1 rBCG-IT was induced by heating to express and detected by Western blot

2.2 重組卡介苗誘導(dǎo)的特異性血清抗體滴度

重組卡介苗rBCG-IT組IgG、IgG1及IgG2a抗體滴度在免疫后6～12周均明顯高于BCG組 (Plt;0.01)。IgG2a/ IgG1比值(圖2)變化趨勢(shì)提示，重組卡介苗rBCG-IT可誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答。而在對(duì)照組PBST組，各時(shí)間點(diǎn)的抗體滴度均維持在較低的1∶20或1∶40水平。

2.3 脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

從免疫后6～12周，重組卡介苗rBCG-IT組刺激指數(shù)顯著高于其他各組(Plt;0.01)。在免疫后9周，增殖反應(yīng)達(dá)到高峰，12周時(shí)有所下降，但仍維持在較高水平。rBCG-I組、rBCG-T組及rBCG-361組脾細(xì)胞增殖反應(yīng)與BCG相當(dāng)(圖3)。

2.4 免疫小鼠CD4+T和CD8+T細(xì)胞亞型受抗原刺激后的比例變化

免疫后9～12周，如表1所示，rBCG-IT組CD4+T陽性細(xì)胞百分比均明顯高于其他各組(Plt;0.01)。

2.5 細(xì)胞因子的誘生

在免疫后各時(shí)間點(diǎn)，rBCG-IT組IFN-γ的誘生量均顯著高于BCG組 (Plt;0.01，圖4)。

A,B,C.shows antibody levels of IgG, IgG1 and IgG2a, respectively*showsPlt;0.01, versus rBCG-361,BCG or PBST group; the ratio of IgG2a/IgG1(D) indicated a shift towards a Th1 immune response in rBCG-IT group

圖2免疫小鼠血清特異性IgG、IgG1和IgG2a抗體滴度水平分析
Fig2AnalysisofIgG,IgG1andIgG2aantibodytitersofimmunizedmice(n=4)

*Plt;0.01 compared with rBCG-I or rBCG-T group; #Plt;0.01 compared with rBCG-361 group, BCG group, or PBST group圖3 脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)Fig 3 Lymphoproliferative response to specific

*Plt;0.01 compared with BCG group, rBCG-I group, rBCG-T group, rBCG-361 group or PBST group圖4 細(xì)胞因子IFN-γ的誘生Fig 4 IFN-γ production by splenocytes from immunized

3 討論

重組卡介苗具有較多優(yōu)勢(shì)，如安全、廉價(jià)、容易獲取及保存方便，更重要的是，它是活疫苗，可在體內(nèi)不斷繁殖而長(zhǎng)期存活，不斷分泌自身蛋白及重組蛋白，持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生長(zhǎng)期的免疫應(yīng)答。因此，重組卡介苗在新型結(jié)核病疫苗研發(fā)中更具可行性及研究?jī)r(jià)值。

表1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+和CD8+細(xì)胞的比例Table 1 Percentages of CD4+ T and CD8+ T splenocyte subsets detected by flow cytometry(±s, %, n=4)

*Plt;0.01 compared with BCG group, rBCG-I group, or rBCG-361 group, or PBST group；#Plt;0.01 compared with BCG group, rBCG-361group, or PBSTgroup;ΔPlt;0.01 compared with BCG group, rBCG-361group, or PBST group.

從本研究結(jié)果看，重組疫苗rBCG-IT和rBCG-T均可誘導(dǎo)產(chǎn)生較BCG更強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，凸顯了TB10.4較強(qiáng)的免疫刺激功能。而與rBCG-T相比，rBCG-IT可誘導(dǎo)產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答，尤以高水平IFN-γ誘生量及長(zhǎng)時(shí)間免疫應(yīng)答的維持最為突出。其原因在于，重組卡介苗rBCG-IT在表達(dá)免疫刺激性抗原TB10.4的同時(shí)，還可表達(dá)免疫調(diào)節(jié)因子IL-12p70，該細(xì)胞因子可廣泛調(diào)節(jié)多功能免疫細(xì)胞的功能，促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子如IFN-γ等的產(chǎn)生[9]，而多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生則有利于機(jī)體對(duì)休眠M(jìn)TB的識(shí)別和清除，從而更有效的控制結(jié)核病的發(fā)生。本研究提示，重組卡介苗rBCG-IT與其他結(jié)核病疫苗相比，在預(yù)防休眠M(jìn)TB中更具優(yōu)勢(shì)，值得深入探究。

[1] Russell DG, Barry CE, Flynn JL. Tuberculosis: what we don’t know can, and does, hurt us [J]. Science, 2010, 328:852-856.

[2] Aagaard C, Hoang T, Dietrich J,etal. A multistage tuberculosis vaccine that confers efficient protection before and after exposure [J]. Nat Med, 2011, 17:189-194.

[3] 鄧毛子, 石春薇, 王芳, 等. 結(jié)核分枝桿菌Ag85A蛋白的原核表達(dá)、純化和免疫反應(yīng)性 [J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2010, 30: 117-121.

[4] Kato-Maeda M, RheeJT, Gingeras TR,etal. Comparing genomes within the species Mycobacterium tuberculosis [J]. Genome Res, 2001, 11:547-554.

[5] Hoft DF, Blazevic A, Stanley J,etal. A recombinant adenovirus expressing immunodominant TB antigens can significantly enhance BCG-induced human immunity [J]. Vaccine, 2012, 30: 2098-2108.

[6] Elvang T, Christensen JP, Billeskov R,etal. CD4 and CD8 T cell responses to the M.tuberculosis Ag85B-TB10.4 promoted by adjuvanted subunit, adenovector or heterologous prime boost vaccination [J]. PLoS One, 2009, 4: e5139.doi:10.1371/journal.pone.0005139.

[7] Aristoff PA, Garcia GA, Kirchhoff PD,etal. Rifamycins-obstacles and opportunities [J]. Tuberculosis (Edinb), 2010, 90:94-118.

[8] Trinchieri G. Interleukin-12 and the regulation of innate resistance and adaptive immunity [J]. Nat Rev Immunol, 2003, 3:133-146.

[9] Sutherlang JS, de Jong BC, Jeffries DJ,etal. Production of TNF-alpha, IL-12(p40) and IL-17 can discriminate between active TB disease and latent infection in a West African cohort [J]. PLos One, 2010, 5:e12365.doi:10.137/journal.pone.0012365.

Immunization efficacy of a recombinant tuberculosis vaccine of rBCG-IL-12p70-TB10.4

ZHANG Feng-jing, HE Hong-yun, DENG Yi-hao*, YANG Kai-ming

(Dept. of Anatomy, College of Preclinical Medicine, Dali University, Dali 671000, China)

ObjectiveThe recombinant Bacilli Calmette-Guérin (BCG) of rBCG-IL-12p70-TB10.4 was used to vaccinate in BALB/c mice to investigate its immunogenicity, and to prepare for exploring new vaccines againstMycobacteriumtuberculosis(MTB).MethodsFusion gene of IL-12p70-TB10.4 was cloned into multiple cloning sites of plasmid pMV361 to construct recombinant plasmid. The recombinant plasmid was transformed into BCG using Electroportation Generator to construct MTB vaccine of rBCG-12p70-TB10.4(rBCG-IT) and then Balb/c mice were immunized in 3, 6, 9, 12 weeks after immunization, antibody titer was fitrated by indirect ELSIA, and cellular response was evaluated by XTT, ratios of CD4+T and CD8+T cells were detected by flow cytometry, and IFN-γ production was measured by ELISA kit.ResultsThe recombinant vaccine of rBCG-IT was able to induce high level of specific antibody, stronger proliferative responses and greater IFN-γ production as compared with BCG vaccine.ConclusionsThe recombinant vaccine of rBCG-IT may elicit stronger and more long-lasting humoral and cell-mediated responses compared with BCG vaccine, and was worth exploring its protective efficacy.

recombinant BCG; IL-12p70; TB10.4; immunization efficacy

2013-03-01

2013-05-02

大理學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金(KYBS201103)

*通信作者(correspondingauthor)： deng13032871868@163.com

1001-6325(2014)01-0093-05

R 392.9

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