氮用量對烤煙成熟期葉片碳氮代謝及萜類代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

王紅麗,楊惠娟,蘇菲,3,李海江,張要旭,楊軍杰,史宏志

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，河南 鄭州 450002；

2河南省煙草公司平頂山市公司，河南 平頂山 467002；

3 云南省煙草公司,昆明市公司東川分公司，云南 昆明 654199

氮用量對烤煙成熟期葉片碳氮代謝及萜類代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

王紅麗1,楊惠娟1,蘇菲1,3,李海江2,張要旭2,楊軍杰1,史宏志1

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，河南 鄭州 450002；

2河南省煙草公司平頂山市公司，河南 平頂山 467002；

3 云南省煙草公司,昆明市公司東川分公司，云南 昆明 654199

為探索氮用量對烤煙碳氮代謝的影響，在前期不同氮素營養(yǎng)水平上在成熟期統(tǒng)一調(diào)虧，分析烤煙葉片糖代謝、氮代謝、淀粉代謝及萜類代謝相關(guān)關(guān)鍵基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：糖代謝中3個關(guān)鍵基因，胞外蔗糖轉(zhuǎn)化酶(Inv)和蔗糖合成酶(SuS)基因隨著煙葉的成熟表達(dá)量升高，在不同氮水平處理間表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。蔗糖磷酸合成酶(SPS )基因表達(dá)量在煙葉成熟前期隨之前施氮量的降低而降低。淀粉代謝中顆粒結(jié)合型淀粉合成酶( GBSSI )基因表達(dá)量既不受煙葉成熟時期的影響也不受前期供氮水平的影響。氮代謝中硝酸還原酶（NR）基因在不同成熟時期及不同的供氮處理間表達(dá)量均無差異。谷氨酰胺合成酶（GS） 基因的表達(dá)量在煙葉成熟后期呈降低趨勢，且受前期供氮水平的影響較大。萜類代謝途徑中3-羥-3甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）基因表達(dá)量隨著煙葉的成熟先升高再降低，在成熟后期表達(dá)量隨前期供氮水平的降低而降低。表明在前期供氮水平不一致的基礎(chǔ)上于成熟期統(tǒng)一調(diào)虧，對成熟后期煙葉氮素的同化吸收過程和萜類代謝影響較大。煙葉糖代謝和淀粉代謝受煙葉成熟時期的影響最大。

烤煙；氮素；碳氮代謝；基因表達(dá)

氮素對植物生命活動有極其重要的作用。氮素是蛋白質(zhì)、核酸、磷脂等的主要組成成分，氮在植物體內(nèi)的主要存在形態(tài)是蛋白質(zhì)[1-2]。在煙葉各種代謝過程中，碳氮代謝是最基本和最重要的代謝，其代謝強度和協(xié)調(diào)程度對煙葉的生長發(fā)育和決定煙葉產(chǎn)量品質(zhì)各類化學(xué)成分的形成轉(zhuǎn)化有重要影響，直接或間接關(guān)系到煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)的形成和提高[3]。拓陽陽[4]研究表明硝酸還原酶和轉(zhuǎn)化酶活性都存在顯著性差異，隨著煙葉的生長成熟，葉綠素、硝酸還原酶和轉(zhuǎn)化酶活性均呈下降趨勢，不同烤煙品種不同生長階段的碳氮代謝強度具有顯著性差異。許晨曦[5]研究表明隨氮素水平的提高同一品種煙草的硝酸還原酶、蔗糖轉(zhuǎn)化酶、淀粉酶活性均提高；但在成熟期，增加施氮量后，煙草的淀粉酶活性反而降低。云菲[6]等研究結(jié)果表明隨著光強的降低轉(zhuǎn)化酶(INV)活性逐漸降低，但充足的氮素營養(yǎng)能夠促進碳代謝。隨光強減弱和施氮量增加，煙堿、總氮含量上升，碳水化合物含量下降，總體上呈現(xiàn)氮代謝強于碳代謝的趨勢。史宏志[7]研究發(fā)現(xiàn)，在葉片功能盛期以前，隨著施氮量的增加，淀粉酶活性增高，碳的固定和轉(zhuǎn)化增強，但碳積累代謝減弱；煙葉成熟階段，淀粉酶活性高時，碳的分解代謝旺盛，其活性與施氮量呈負(fù)相關(guān)。隨著施氮水平的增高，煙葉各期的轉(zhuǎn)化酶活性均升高，表明增施氮肥可以促進碳代謝的增強。岳俊芹[8]對不同氮素形態(tài)影響的研究發(fā)現(xiàn)，純施硝態(tài)氮有利于還原糖的積累；純施銨態(tài)氮的煙葉中谷酰胺合成酶和蔗糖合成酶活性在成熟期一直保持在相對較高的水平上，煙堿含量最高；硝態(tài)氮與銨態(tài)氮各占50%的情況下，煙葉碳氮代謝協(xié)調(diào)。

目前，關(guān)于氮素營養(yǎng)對煙葉生長發(fā)育和品質(zhì)影響的研究多集中在大田條件下控制氮素用量和氮素形態(tài)比例等方面[9-11]，但大田條件下很難實現(xiàn)氮素營養(yǎng)的動態(tài)精準(zhǔn)調(diào)控。氮素供應(yīng)不足將導(dǎo)致煙葉刺激性降低，勁頭不足；氮素過多，則煙株氮代謝旺盛，煙葉難以正常生理成熟。合理的施氮量可以保證煙株正常的生長發(fā)育，達(dá)到體內(nèi)碳氮代謝平衡，有利于優(yōu)良品質(zhì)的形成。鑒于此，本文采用盆栽試驗，在育苗基質(zhì)固持的條件下進行全營養(yǎng)液培養(yǎng)，使煙株前期生長在不同氮素營養(yǎng)條件下，后期則進行氮素調(diào)虧，減少其氮素供應(yīng)，研究了不同生長時期氮素精準(zhǔn)動態(tài)供應(yīng)對烤煙碳氮代謝關(guān)鍵基因表達(dá)水平的影響，以期為烤煙的動態(tài)精準(zhǔn)施肥提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究在河南省郟縣采用盆栽試驗套盆設(shè)計，供試品種為烤煙NC297。盆栽試驗中種植盆缽高30 cm，直徑35 cm，底盆直徑40 cm，所用填充固持材料為烤煙育苗基質(zhì)。煙株生長營養(yǎng)全部由Hoagland營養(yǎng)液提供，營養(yǎng)液組成為NH4NO3、KH2PO4、K2SO4、MnSO4、H3BO3、CuSO4、ZnSO4、EDTAFe、MgSO4、Ca(NO3)2·4H2O、H2MoO4、H2O。采 用分析純試劑配制Hoagland營養(yǎng)液，營養(yǎng)液中各種元素 N、P、K、Mg、Zn、Cu、Mn、B、Mo、Fe的 質(zhì)量濃度分別為140、40、300、40、0.05、0.02、0.50、0.50、0.05、5.60 mg/L。

1.2 試驗設(shè)計

研究設(shè)計了前期不同氮素營養(yǎng)協(xié)同成熟期氮素調(diào)虧試驗，共設(shè)4個處理，每個處理栽種8盆。烤煙于2012年5月10號移栽，團棵前每5 d添加1次營養(yǎng)液，之后每3 d添加1次營養(yǎng)液。移栽后28 d進入團棵期，移栽后56 d打頂，打頂后進行同量氮素調(diào)虧，即把氮素質(zhì)量濃度降至35 mg/L，Hoagland營養(yǎng)液中其余元素濃度保持不變。團棵前N1、N2、N3、N4處理每次分別添加營養(yǎng)液的體積為：2.250 L、1.875 L、1.500 L、1.125 L，其中N2處理為根據(jù)大田推薦施氮量確定的正常施氮量,添加后均按差量用清水補足到2.5 L；團棵后N1、N2、N3、N4處理每次分別添加營養(yǎng)液的體積為：2.725 L、2.213 L、1.700 L、1.188 L，添加后均按差量用清水補足到3.0 L。打頂后各處理每次分別添加營養(yǎng)液的體積均為1 L，按差量用清水補足到2 L。

1.3 碳氮代謝基因和萜類代謝基因的RT-PCR檢測

分別在移栽后60 d，70 d和80 d選取生長發(fā)育良好的不同煙株的 3 片上二棚葉，于液氮中冷凍保存。采用Trizol 法提取煙草總RNA[12]，通過隨機引物法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。檢測內(nèi)參基因L25[13]及目的基因lnv、SuS、SPS、GBSS、NR1、GS和HMGR表達(dá)量用的引物如表1.PCR體系：cDNA1 μL ，diH2O 為11 μL，上游引物和下游引物均為1.5 μL，含染料的Taqmix 為15 μL，整個PCR體系共30 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；退火溫度依各引物Tm值變化而變化(47℃～60℃)；72℃延伸1 min；35 個循環(huán)；72℃延伸10 min，于4℃保存。

表1 擴增引物序列Tab.1 Amplification primer sequence

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

采用LaunchVisionWorksLS軟件對RT-PCR檢測所得半定量圖片進行量化，提取各個基因表達(dá)的亮度相對值進行對比，每個基因均以移栽后60天N2處理為基準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮素營養(yǎng)協(xié)同成熟期同量調(diào)虧處理對糖代謝關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

胞外蔗糖轉(zhuǎn)化酶(extracellular invertase,Inv)，在高等植物蔗糖代謝中起著關(guān)鍵的作用，參與植物的生長、器官建成、糖分運輸、韌皮部卸載及調(diào)節(jié)庫組織糖分構(gòu)成及水平，其酶活性常作為衡量碳代謝強度的重要指標(biāo)；如圖1表2所示，Inv基因的表達(dá)強度隨生育期的推進而逐漸增強，移栽后60天表達(dá)量均較低，在處理間表現(xiàn)為N1＜N2＜N3＜N4。而在移栽后70天、80天表達(dá)量明顯增加，70天時處理間沒有明顯差異，80天時表現(xiàn)為基因表達(dá)量隨前期施氮量的增加而增加。蔗糖合成酶( sucrose synthase,SuS)主要是將運輸入葉片中的蔗糖降解,提供合成淀粉等多糖的葡萄糖供體,承擔(dān)著非光合組織中為其它合成反應(yīng)提供核苷酸糖類的任務(wù)。SuS基因在不同的生育期表達(dá)量不同，隨生育期的推進表達(dá)量有逐漸增加的趨勢，但不如Inv基因表達(dá)量增加明顯。蔗糖磷酸合成酶( sucrosephosphate synthase,SPS )，是催化蔗糖生成的關(guān)鍵酶，也是控制碳素分配和流向的關(guān)鍵酶[14]。SPS基因在移栽后60天表達(dá)強度弱于其余兩個時期，SPS基因表達(dá)量在移栽后60天時四個處理間有差異，N3處理亮度相對值為59.3明顯低于其余各處理，在70天與80天時表達(dá)量在發(fā)育時期與處理間均無明顯差異（圖1，表2）。

圖1 不同發(fā)育時期烤煙 Inv,SuS和SPS基因的檢測結(jié)果Fig.1 Results of Inv,SuS,SPS genes on different growing stages

表2 氮素營養(yǎng)協(xié)同成熟期同量調(diào)虧處理對糖代謝關(guān)鍵基因表達(dá)的影響Tab.2 Effects of regulated deficit of nitrogen nutrition during mature stage on expression of key genes in carbohydrate metabolism

2.2 氮素營養(yǎng)協(xié)同成熟期同量調(diào)虧處理對淀粉代謝關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

顆粒結(jié)合型淀粉合成酶( GBSSI )，是控制直鏈淀粉合成的關(guān)鍵酶。如圖2表3所示，GBSSI基因在不同發(fā)育時期表達(dá)量變化不大，同一時期不同處理間差異不明顯，在移栽后70天N4處理表達(dá)量相對值為126.9稍高于其余各處理，移栽后80天N4處理表達(dá)量相對值為84.0低于其余各處理(圖2，表3)。

圖2 不同發(fā)育時期烤煙GBSSI基金的檢測結(jié)果Fig.2 Results of GBSSI gene on different growing stages

表3 氮素營養(yǎng)協(xié)同成熟期同量調(diào)虧處理對GBSSI基因表達(dá)的影響Tab.3 Effects of regulated deficit of nitrogen nutrition during mature stage on expression of GBSSI gene

2.3 氮素營養(yǎng)協(xié)同成熟期同量調(diào)虧處理對氮代謝關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

硝酸還原酶（NR），是氮代謝的第一個關(guān)鍵酶和限速酶，主要作用是把NO3-離子還原成NO2-離子。如圖3表4所示，NR的基因表達(dá)量隨生育期的推進先升高再降低，在同一時期不同處理間無明顯差異。谷氨酰胺合成酶（glutamine synetase，GS,又稱為N素轉(zhuǎn)移酶）催化產(chǎn)生谷氨酰胺，GS常與谷氨酸合酶（glutamate synmase，GOGAT）協(xié)同作用，組成GS/GOGAT循環(huán)，這是高等植物NH4+同化的主要途徑。GS基因的表達(dá)量在移栽后70天高于其余兩個時期，在移栽后60天和70天時各處理間表達(dá)量沒有明顯差異，在80天時N3、N4處理的亮度相對值分別為70.1,54.1明顯低于N1,N2處理（圖3，表4）。

圖3 不同發(fā)育時期烤煙NR和GS基因的檢測結(jié)果Fig.3 Results of NR and GS genes on different growing stages

表4 氮素營養(yǎng)協(xié)同成熟期同量調(diào)虧處理對氮代謝關(guān)鍵基因表達(dá)的影響Tab.4 Effects of regulated deficit of nitrogen nutrition during mature stage on expression of key genes in nitrogen metabolism

2.4 氮素營養(yǎng)協(xié)同成熟期同量調(diào)虧處理對萜類代謝關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

3-羥-3甲基戊二酰輔酶A還原酶( HMGR)，是植物甲羥戊酸途徑調(diào)控的第一個限速酶，也是細(xì)胞質(zhì)萜類代謝中的重要調(diào)控位點。如圖4表5所示，HMGR基因的表達(dá)量在移栽后70天時各處理的基因表達(dá)量均高于移栽后60天時的表達(dá)量，隨之在移栽后80天時表達(dá)量又逐漸降低。四個處理間的表達(dá)量有明顯差異，在移栽后60天N3,N4處理HMGR基因表達(dá)量亮度相對值分別為204.5,183.0明顯高于N1,N2處理，移栽后70天N1處理亮度相對值為387.9明顯低于其余各處理，移栽后80天表現(xiàn)為隨前期施氮量的增加基因表達(dá)強度增強(圖4，表5)。

圖4 不同發(fā)育時期烤煙HMGR基金檢測結(jié)果Fig.4 Results of HMGR gene on different growing stages

表5 氮素營養(yǎng)協(xié)同成熟期同量調(diào)虧處理對HMGR基因表達(dá)的影響Tab.5 Effects of regulated deficit of nitrogen nutrition during mature stage on expression of HMGR gene

3 討論

在煙葉生長和成熟過程中其碳氮代謝的動態(tài)變化對煙葉品質(zhì)都會產(chǎn)生重大影響[3]。本研究表明，糖代謝中3個關(guān)鍵基因，胞外蔗糖轉(zhuǎn)化酶和蔗糖合成酶基因表達(dá)均受煙葉成熟時期的影響較大，煙葉越趨向成熟其基因表達(dá)量越高，而不受前期氮素施用量影響，在各個時期的4個處理間2個基因的表達(dá)量均無差異。但SuS基因的表達(dá)量整體低于Inv基因。SPS基因的表達(dá)量在煙葉成熟前期隨打頂前施氮量的降低而降低，隨著煙葉成熟期的退后表達(dá)量在4個處理間趨于一致。糖代謝3個關(guān)鍵基因表達(dá)量的變化說明打頂后隨著煙葉的成熟糖代謝關(guān)鍵基因表達(dá)量均趨向升高，表明糖代謝活動也越來越活躍，糖代謝過程受煙葉成熟時期影響較大而受前期氮素施用量影響較小。

淀粉代謝中顆粒結(jié)合型淀粉合成酶( GBSSI )基因表達(dá)既不受煙葉成熟時期的影響也不受前期供氮水平的影響，表明前期供氮對淀粉合成代謝影響不大。

氮代謝中硝酸還原酶（NR）基因在不同成熟時期和不同的前期供氮處理間表達(dá)量均無差異。N素轉(zhuǎn)移酶GS基因 的表達(dá)強度在成熟前期無差異，越到煙葉成熟后期表達(dá)量越低且隨前期供氮水平的降低表達(dá)量也降低。結(jié)果說明氮代謝途徑中煙葉固氮能力隨著煙葉的成熟而降低，且前期供氮水平越低氮素吸收能力也將越低。

萜類代謝MVA途徑中3-羥-3甲基戊二酰輔酶A還原酶HMGR是控制萜類代謝的限速酶，其表達(dá)量隨著煙葉的成熟先升高再降低，在成熟前期表達(dá)量在四個處理間均較低，在成熟中期表達(dá)量都升高，而在成熟后期表達(dá)量隨即又降低，但在這一時期表達(dá)量受前期供氮水平的影響，前期供氮越高，其表達(dá)量也越高。結(jié)果表明萜類代謝在煙葉成熟中期最活躍，前期供氮水平對煙葉成熟后的萜類代謝影響最大。

綜上所述，在前期供氮水平不一致的基礎(chǔ)上成熟期統(tǒng)一調(diào)虧，對煙葉糖代謝和淀粉代謝影響不大，而對成熟后期煙葉氮素的同化吸收過程和萜類代謝影響較大。

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Effects of nitrogen on expression of key genes related to carbon/nitrogen metabolism and terpenoid metabolism in matruing flue-cured tobacco leaves

WANG Hongli1,YANG Huijuan1,SU Fei1,3,LI Haijiang2,ZHANG Yaoxu2,YANG Junjie1,SHI Hongzhi1

1 College of Tobacco,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China;
2 Henan Pingdingshan Tobacco Company,Pingdingshan 467002,Henan,China;
3 Kunming Dongchuan Tobacco Company,Yunnan Provincial Tobacco Company,Kunming 654199,China

Expression of key genes involved in sugar,nitrogen,starch and terpenoid metabolism pathways were tested by regulated deficit nitrogen nutrition to study effects of different nitrogen applications on carbon and nitrogen metabolism in flue-cured tobacco.Results indicated that in sugar metabolism pathway Inv and SuS genes’ expression increased when tobacco leaf became more mature while not affected by early nitrogen level.Expression of SPS gene decreased with decline of nitrogen supply at early maturing stage.GBSSI gene in starch metabolism pathway was not affected by either maturity or early nitrogen supply.GS gene expressed at lower level in maturing stage and affected by early nitrogen supply while NR gene expression was not affected.HMGR gene expression in terpenoid metabolism pathway decreased when leaf became more mature and decreased with decline of early nitrogen supply.The assimilation of nitrogen and terpenoid metabolism were significantly affected when regulated deficit of nitrogen was applied at early growing stage.Sugar and starch metabolism were affected mostly at leaf maturing stage.

flue-cured tobacco; nitrogen; carbon and nitrogen metabolism; gene expression

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.05.019

S572.6; Q81 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1004-5708（2014）05-0116-05

河南省煙草公司科技項目（HYKJ2012M06）

王紅麗（1989—），在讀碩士，主要從事煙草栽培生理研究,Email：379714360@qq.com

史宏志（1963—），博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事煙草栽培生理研,Email:shihongzhi88@163.com

2013-10-14