黃芪多糖對過氧化氫誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞氧化損傷的保護作用

司俊康 郭俊國 唐 凱 杜宇翔 郭大東 王興榮

2山東中醫(yī)藥大學(xué)眼科研究所

3山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬眼科醫(yī)院

糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）是嚴重影響人們生活質(zhì)量的主要致盲性眼病之一。DR的主要機制是高血糖造成的微血管病變，毛細血管功能障礙可以導(dǎo)致視網(wǎng)膜局部缺血缺氧以及由此引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（retinal ganglion cell，RGC）的氧化應(yīng)激損傷〔1-3〕。研究表明，通過藥物干預(yù)可以抑制DR患者RGC的凋亡，從而改善患者的視功能〔4〕。黃芪多糖（astragalus polysaccharide，APS）是從黃芪中提取的主要活性成分，具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)血糖等作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)黃芪多糖對于體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞具有抗氧化保護作用〔5〕，但是其對體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞是否具有抗氧化保護作用尚不清楚。本實驗通過觀察黃芪多糖對過氧化氫誘導(dǎo)的大鼠RGC細胞氧化損傷的保護作用，為黃芪多糖及黃芪類藥物治療DR提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

傳代培養(yǎng)的RGC細胞株RGC-5由吉林大學(xué)白求恩第二醫(yī)院眼科醫(yī)院惠贈。RGC-5置于含10%胎牛血清（FBS）（美國 Hyclone公司)，1 g/L 葡萄糖和谷氨酰胺，100 U/ml青霉素，100 U/ml鏈霉素的 Dulbecco改良 Eagle培養(yǎng)液（DMEM）（美國 Hyclone公司）的培養(yǎng)瓶中，于體積分數(shù)5%CO2、37℃的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；隔夜換液，然后取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。 配制含 250 μg/ml、500 μg/ml、1 000 μg/ml黃芪多糖（西安奧澤生物科技有限公司）的DMEM高糖培養(yǎng)液；胰蛋白酶凍干粉（含EDTA）（美國Sigma公司）。流式細胞儀（美國BD公司），倒置相差顯微鏡（日本 OlympusⅨ71，日本 Olympus公司），酶聯(lián)免疫檢測儀（美國伯騰儀器有限公司），實時細胞電子分析系統(tǒng)（xCELLigence System，瑞士Roche公司），Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒（碧云天生物公司），噻唑藍（MTT）（美國 Sigma 公司），4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，美國 Sigma公司）。

1.2 實驗分組

RGC-5細胞分為正常對照組、陰性對照組、過氧化氫損傷組、黃芪多糖干預(yù)組。正常對照組不做任何處理，陰性對照組和過氧化氫損傷組分別加入1 000 μg/ml的黃芪多糖和100 μmol/L的過氧化氫，黃芪多糖干預(yù)組在加入不同劑量濃度（1 000 μg/ml、500 μg/ml、250 μg/ml）黃芪多糖孵育 12 h 后加入 100 μmol/L的過氧化氫作用24 h，然后用倒置相差顯微鏡觀察各組細胞形態(tài)變化。

1.3 MTT法檢測細胞活性

采用MTT比色法檢測RGC-5細胞的活性。取處于對數(shù)生長期的RGC-5，接種于96孔板，1×104個/L。按各個分組的要求處理后，每孔加入5 mg/ml的 MTT溶液 20 μL，孵育4 h，然后棄掉上清，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）溶液 150 μl，低速振蕩 10 min，選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光密度，細胞活性以相對于正常對照組的百分比表示。

1.4 DAPI染色

應(yīng)用DAPI染色觀察各組細胞核形態(tài)學(xué)變化。取處于對數(shù)生長期的RGC-5細胞，接種于6孔板，1×104個／L。按各組要求處理后，每孔用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，每孔加入4%的多聚甲醛固定液固定15 min，然后加入5 μg/ml的DAPI染色液室溫作用15 min。在倒置相差顯微鏡下觀察并記錄實驗結(jié)果。

1.5 實時細胞電子分析（RT-CES）

應(yīng)用RT-CES系統(tǒng)監(jiān)測各組細胞的生長的動態(tài)信息。RT-CES是基于檢測電子傳感器阻抗變化以反映細胞生理狀態(tài)的新型細胞分析系統(tǒng)。在RTCES系統(tǒng)中，傳感器培養(yǎng)板的底部有特殊的傳感器陣列，靶細胞可以直接生長在傳感器表面，造成傳感器阻抗的變化，從而實時記錄靶細胞的生長狀態(tài)。在RT-CES 系統(tǒng)中，應(yīng)用細胞指數(shù)（cell index，CI）來反映細胞的生長狀態(tài)〔6〕。將RGC-5細胞接種于16孔的RT-CES傳感器培養(yǎng)板上，密度1×104個/L，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，24 h后按上述實驗分組處理，記錄處理后72 h內(nèi)的細胞生長狀態(tài)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準差表示，各樣本經(jīng)Levene檢驗總體方差相等，采用單因素方差分析，各組間的兩兩比較采用LSD檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 倒置相差顯微鏡下各組細胞形態(tài)

正常生長的RGC-5細胞呈扁平梭形，細胞透亮，邊緣清晰，有較短突起，隨著細胞生長，突起相互連接（圖1A）。過氧化氫損傷組RGC-5細胞皺縮，細胞密度減低，軸突縮短（圖1C）。其他各組RGC-5細胞形態(tài)變化不大，僅見少量細胞皺縮（見圖1B，圖1D～圖 1F）。

圖1 各組RGC-5細胞倒置熒光顯微鏡像。1A.正常對照組；1B.陰性對照組；1C.過氧化氫損傷組；1D.1 000 μg/ml干預(yù)組；1E.500 μg/ml干預(yù)組；1F.250 μg/ml干預(yù)組。正常生長的RGC-5細胞呈扁平梭形，細胞透亮，邊緣清晰，有較短突起，隨著細胞生長，突起相互連接。過氧化氫損傷組RGC-5細胞皺縮，細胞密度減低，軸突縮短。其他各組RGC-5細胞形態(tài)未見明顯改變（×200倍）RGC：視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞

2.2 MTT檢測

陰性對照組、過氧化氫損傷組以及1 000 μg/ml、5 00 μg/ml、250 μg/ml的黃芪多糖干預(yù)組的細胞活性分別為（98.17±1.06）%、（64.22±2.10）%、（88.14±2.62）%、（81.51±1.48）%、（78.37±1.64）%。 與正常對照組相比，過氧化氫損傷組RGC-5細胞的活性明顯降低（P＜0.01）。 與過氧化氫損傷組相比，1 000 μg/ml、500 μg/ml、250 μg/ml濃度的黃芪多糖干預(yù)組的細胞活性明顯升高（P＜0.01）（圖 2）。

圖2 各組RGC-5細胞活性檢測結(jié)果。A.正常對照組；B.陰性對照組；C.過氧化氫損傷組；D.1 000 μg/ml干預(yù)組；E.500 μg/ml干預(yù)組；F.250 μg/ml干預(yù)組 RGC：視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞

2.3 DAPI染色

正常對照組（圖 3A）和陰性對照組（圖 3B）RGC-5細胞核核型完整，細胞核淡染，染色質(zhì)均勻，未見明顯凋亡表現(xiàn)；過氧化氫損傷組（圖3C）RGC-5細胞核發(fā)生形變，可見染色質(zhì)凝聚，邊緣化；各個濃度干預(yù)組（圖3D～圖 3F）的RGC-5細胞核基本完整，少量細胞可見染色質(zhì)濃縮現(xiàn)象。

2.4 實時細胞電子分析（RT-CES）

圖4反映了不同分組細胞的生長狀態(tài)。從圖中可以看出，與正常對照組（曲線a）和陰性對照組（曲線b）相比，過氧化氫損傷組（曲線f）RGC-5細胞的生長明顯受到抑制。與過氧化氫組相比，不同濃度黃芪多糖干預(yù)組（曲線c、d、e）RGC-5細胞的細胞指數(shù)有所上升。

3 討論

近年來，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡與氧化應(yīng)激機制的研究越來越多。氧化應(yīng)激機制認為，細胞內(nèi)氧化代謝產(chǎn)物積累導(dǎo)致細胞毒性損傷，從而造成細胞凋亡〔7-8〕。應(yīng)用過氧化氫損傷模擬體內(nèi)環(huán)境中細胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)，已經(jīng)為眾多的實驗所證實〔9-14〕。本實驗在過氧化氫誘導(dǎo)RGC-5細胞氧化損傷的基礎(chǔ)上觀察黃芪多糖對RGC-5細胞的保護作用，從而探討黃芪多糖保護視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的作用機制，并為黃芪多糖的臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

圖3 各組RGC-5細胞DAPI染色圖像。3A.正常對照組；3B.陰性對照組；3C.過氧化氫損傷組；3D.1 000 μg/ml干預(yù)組；3E.500 μg/ml干預(yù)組；3F.250 μg/ml干預(yù)組。正常對照組和陰性對照組RGC-5細胞核核型完整，細胞核淡染，染色質(zhì)均勻，未見明顯凋亡表現(xiàn)；過氧化氫損傷組RGC-5細胞核發(fā)生形變，可見染色質(zhì)凝聚，邊緣化；各個濃度干預(yù)組的RGC-5細胞核基本完整，少量細胞可見染色質(zhì)濃縮現(xiàn)象（×200倍）RGC：視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞

圖4 實時細胞電子分析。a.正常對照組；b.陰性對照組；c.1000μg/ml干預(yù)組；d.500 μg/ml干預(yù)組；e.250 μg/ml干預(yù)組；f.過氧化氫損傷組。與正常對照組相比，陰性對照組和各個濃度黃芪多糖干預(yù)組呈現(xiàn)正常的細胞生長曲線，過氧化氫損傷組細胞生長明顯受到抑制

黃芪是臨床上常用的補氣類藥物，在糖尿病及糖尿病視網(wǎng)膜病變和糖尿病腎病中應(yīng)用較多。循證醫(yī)學(xué)證據(jù)也證實了黃芪類藥物對于糖尿病治療的有效性〔15〕。黃芪多糖是黃芪中提取的有效成分，具有增強心肌收縮力、擴張冠狀動脈、保護心肌細胞、改善心肌功能的作用，此外還有清除自由基、改善微循環(huán)、調(diào)節(jié)免疫等多種有益的生物學(xué)效應(yīng)〔16-19〕。動物實驗證實，黃芪多糖對于周圍神經(jīng)損傷的功能恢復(fù)具有促進作用，而且在損傷早期即可發(fā)揮作用〔20〕。

在本實驗中，我們用過氧化氫誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的RGC-5細胞氧化損傷，應(yīng)用不同濃度的黃芪多糖干預(yù)保護，發(fā)現(xiàn)黃芪多糖干預(yù)組的細胞活性及細胞凋亡的數(shù)量較單純過氧化氫損傷組有明顯的逆轉(zhuǎn)，證實了黃芪多糖對過氧化氫誘導(dǎo)的RGC-5細胞氧化損傷的保護作用，提示黃芪多糖對于糖尿病視網(wǎng)膜病變等疾病中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的損傷可能有一定的保護作用，黃芪多糖可能是黃芪類藥物治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的有效成分之一。鑒于體外培養(yǎng)的RGC-5細胞與活體內(nèi)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞有一定差別，對各種損傷的反應(yīng)也可能會有所不同，所以黃芪多糖對于糖尿病視網(wǎng)膜病變RGC的保護作用及其在臨床上的治療效果和具體應(yīng)用還有待進一步研究。

[1]陳美蘭，蔡季平.糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)病機制[J].中國實用眼科雜志，2011，29（6）：521-524.

[2]許迅，劉堃.統(tǒng)一機制學(xué)說和慢性炎癥學(xué)說：糖尿病視網(wǎng)膜病變基礎(chǔ)研究的新方向[J].中華眼底病雜志，2008，24（4）：237-239.

[3]司俊康，郭俊國，王興榮.氧化應(yīng)激誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡的研究進展[J].國際眼科雜志，2013，13（12）：2424-2426.

[4]項楠，林晗，李貴剛，等.銀杏葉提取物對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞Bax和Bcl-2基因表達的影響[J].華中科技大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2008，37（2）：243-246；封 3.

[5]閔清，白育庭，余薇，等.黃芪多糖對乳鼠心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護作用[J].中國藥理學(xué)通報，2010，26（12）：1661-1664.

[6]Wu Q，Guo D，Bi H，et al.UVB irradiation-induced dysregulation of plasma membrane calcium ATPase1 and intracellular calcium homeostasis in human lens epithelial cells[J].Mol Cell Biochem，2013，382（1-2）：263-272.

[7]Li SY，Lo AC.Lutein protects RGC-5 cells against hypoxia and oxidative stress[J].Int J Mol Sci，2010，11（5）：2109-2117.

[8]Gupta VK，You Y，Li JC，et al.Protective effects of 7，8-dihydroxyflavone on retinal ganglion and RGC-5 cells against excitotoxic and oxidative stress[J].J Mol Neurosci，2013，49（1）：96-104.

[9]Dong LY，Jin J，Lu G，et al.Astaxanthin attenuates the apoptosis of retinal ganglion cells in db/db mice by inhibition of oxidative stress[J].Mar Drugs，2013，11（3）：960-974.

[10]Shimazawa M，Nakajima Y，Mashima Y，et al.Docosahexaenoic acid（DHA）has neuroprotective effects against oxidative stress in retinal ganglion cells[J].Brain Res，2009，1251：269-275.

[11]Nakajima Y，Inokuchi Y，Nishi M，et al.Coenzyme Q10 protects retinal cells against oxidative stress in vitro and in vivo[J].Brain Res，2008，1226：226-233.

[12]Nakajima Y，Inokuchi Y，Shimazawa M，et al.Astaxanthin，a dietary carotenoid，protects retinal cells against oxidative stress in-vitro and in mice in-vivo[J].J Pharm Pharmacol，2008，60（10）：1365-1374.

[13]Li GY，Osborne NN.Oxidative-induced apoptosis to an immortalized ganglion cell line is caspase independent but involves the activation of poly（ADP-ribose）polymerase and apoptosis-inducing factor[J].Brain Res，2008，1188：35-43.

[14]陳英，廖敏華，鄭江娉，等.白藜蘆醇對過氧化氫誘導(dǎo)人晶狀體上皮細胞氧化損傷的保護作用[J].眼科新進展，2013，33（6）：513-516.

[15]Cheng L，Zhang G，Zhou Y，et al.Systematic review and meta-analysis of 16 randomized clinical trials of radix astragali and its prescriptions for diabetic retinopathy[J].Evid Based Complement Alternat Med，2013，2013：762783.

[16]陳蔚，俞茂華，葉紅英.黃芪多糖保護糖尿病心肌的初步研究[J].復(fù)旦學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2007，34（4）：541-544；548.

[17]馬蘭軍，田振軍.黃芪多糖對力竭運動大鼠心肌細胞凋亡及BcL-2、Bax蛋白表達的影響[J].華中師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2012，46（2）：214-217.

[18]毛先晴，歐陽靜萍，吳勇.中藥黃芪多糖對糖尿病大鼠心肌GLUT4表達的影響[J].武漢大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2005，26（4）：457-459.

[19]葛斌，許愛霞，楊社華.黃芪多糖抗衰老作用機制的研究[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2004，24（10）：610-612.

[20]桑秋凌，魏壯，許則民，等.黃芪多糖對大鼠損傷坐骨神經(jīng)再生的作用研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2008，19（4）：851-853.