自體骨髓基質干細胞移植聯(lián)合EPO治療脊髓損傷的研究

楊國宏+張春軍+趙富生+孫曉冬+張靜+姚志文+李月珍+梁軍+劉志新

【摘要】 目的：探討自體骨髓基質干細胞（MSCs）移植聯(lián)合促紅細胞生成素（EPO）對大鼠脊髓損傷（SCI）治療的效果。方法：培養(yǎng)與純化骨髓基質干細胞。80只SD大鼠制備脊髓損傷模型，隨機分為4組：干細胞移植組、EPO組、聯(lián)合組和對照組。采用BBB法進行運動能力評分和組織切片觀察來評定修復情況。結果：三個實驗組與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），三個實驗組均可明顯促進大鼠運動功能和損傷后組織結構的恢復，其中聯(lián)合組效果更顯著。結論：骨髓基質干細胞移植聯(lián)合EPO具有促進大鼠脊髓損傷后神經功能的修復。

【關鍵詞】 骨髓基質干細胞； 促紅細胞生成素； 大鼠； 脊髓損傷； 修復

The Study on Autogeneic Esenchymal Stem Cells and Erythropoietin in Treatment of Spinal Cord Injury/YANG Guo-hong，ZHANG Chun-jun，ZHAO Fu-sheng，et al.//Medical Innovation of China，2014，11（32）：001-003

【Abstract】 Objective：To evaluate the effects of transplantation of autogeneic mesenchymal stem cells（MSCs） with erythropoietin（ EPO） therapy after rats spinal cord injury（SCI）.Method：MSCs were cultured and purified in vitro.The rat model with spinal cord injury was prepared by modified Allen method.Eighty rats were put into four groups：stem cell transplation group， EPO treatment group， combination group and control group.The motor function was evaluated with BBB score and the neurological function recovery was observed by HE staining.Result：Statistical differences were showed in inter-group（P<0.05）.Compared with control group，in practical group，the motor function and morphological recoverment was obviously in MSCs combined EPO group.Conclusion：The neurological function of rats with spinal cord can be obviously improved by autogeneic mesenchymal stem cells transplantation combined with EPO.

【Key words】 Mesenchymal stem cell； Erythropoietin； Rat； Spinal cord injury； Repair

First-authors address：Mudanjiang Medical College，Mudanjiang 157011，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.32.001

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是一種常見的神經系統(tǒng)損傷，其致殘率和病死率均較高。目前，脊髓損傷在臨床治療后神經功能的恢復效果不甚理想[1-5]，急需改進，所以，脊髓損傷的治療一直是醫(yī)學研究的熱點問題[6-7]。骨髓基質干細胞（MSCs）具有高度增殖和向多種細胞分化的潛能，可分化為對神經遞質敏感且具有神經電生理特性的細胞，還可以產生多種神經生長因子促進受損的神經纖維修復，移植后可促進脊髓損傷的修復[8]，而且可以自體移植，因此骨髓基質干細胞是治療脊髓損傷的理想種子細胞[9-10]。促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）是一種由腎臟產生的內分泌激素，一直作為治療貧血的藥物而應用于臨床。隨著人們對EPO研究的深入，EPO已被證實是一種新型的神經保護和營養(yǎng)因子，具有神經營養(yǎng)和神經保護作用[11]。本實驗將骨髓基質干細胞和促紅細胞生成素聯(lián)合應用于脊髓損傷大鼠，探討骨髓基質干細胞和促紅細胞生成素聯(lián)合應用是否有協(xié)同效應。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和設備 成年雄性SD大鼠80只，體重200～240 g；8周齡雄性SD大鼠4只，體重約100 g（均由哈爾濱醫(yī)科大學動物試驗中心提供）。二氧化碳細胞培養(yǎng)箱（德國Heraeus公司），倒置相差顯微鏡（日本奧林帕斯公司），低溫離心機（德國Heraeus公司），單人雙面凈化工作臺（蘇州凈化）超純水凈化器（美國Millipore公司），DMEM培養(yǎng)基，Percoll分層液。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立脊髓損傷模型與分組 8周齡的SD大鼠用于骨髓基質干細胞的分離、培養(yǎng)和純化。成年SD大鼠水合氯醛麻醉后，俯臥位固定，找到T10棘突，向上和向下5 cm范圍內進行剪毛消毒。沿正中線切一3 cm長的切口，暴露椎旁肌肉，用玻璃分針剝離肌肉，用骨鉗咬除棘突和椎板，形成方形骨窗，暴露T10脊髓，用脊髓損傷打擊器打擊制成SCI模型。造模的標準是：脊髓出現(xiàn)出血、水腫、后肢遲緩性癱瘓和尾巴痙攣性擺動。沖洗切口后局部使用青霉素，以防感染，縫合后放回鼠籠喂養(yǎng)。按隨機的方式將80只SCI模型的大鼠分為對照組、骨髓基質干細胞應用組、促紅細胞生成素應用組和聯(lián)合應用組，每組20只。對照組每只鼠在脊髓損傷前1 d經腹腔注射相同量的生理鹽水。骨髓基質干細胞治療組將每只鼠采取尾靜脈注射的方法在脊髓損傷后給予第3代培養(yǎng)的骨髓基質干細胞單細胞懸液1 mL（1×106個骨髓基質干細胞）。促紅細胞生成素治療組的每只鼠在脊髓損傷前1 d經腹腔按每千克體重5000單位給予促紅細胞生成素。聯(lián)合治療組每只鼠在脊髓損傷前1 d經腹腔按每千克體重5000單位給予促紅細胞生成素，脊髓損傷后經尾靜脈注射第3代培養(yǎng)的MSCs單細胞懸液1 mL（1×106個骨髓基質干細胞）。

1.2.2 指標檢測 （1）大鼠后肢運動功能的BBB評分：采用Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）評分法 （全癱計0分，正常計21分）[4]。分別于術前1 d，術后第7、14、21、28天取大鼠置于地板上，待大鼠開始連續(xù)行走時，采用雙盲法觀察后肢關節(jié)活動的范圍和數(shù)量，根據(jù)雙下肢步態(tài)協(xié)調以及運動程度進行評分，并記錄。每只觀察3～4 min，對各組鼠的雙側后肢的運動功能進行評分。（2）術后第1、28天行脊髓組織切片：分別將各組里5只大鼠麻醉后，在損傷脊髓處切取2個脊髓節(jié)段，將脊髓放入甲醛液中固定，放入冰箱過夜；取出脊髓置于含30%蔗糖的灌注液中至脊髓組織沉淀；然后進行石蠟固定，切片后行HE染色。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以（x±s）表示，組間比較采用方差分析、獨立樣本比較使用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠后肢運動功能評分 采用BBB評分法，術前大鼠BBB評分均為21分，SCI后為0分。從表中可以看出：對照組、骨髓基質干細胞治療組、促紅細胞生成素治療組和聯(lián)合治療組大鼠后肢運動功能隨時間的變化而變化，表現(xiàn)為隨著造模時間的推移四個組大鼠后肢的運動功能都是逐漸恢復，到第4周的時候每個組都有一定程度的恢復，與術前相比都有不同程度的改善。從手術后第7天起，四個組大鼠下肢功能存在明顯的差別，聯(lián)合組的分值最高，而對照組分值最低。術后7 d起，骨髓基質干細胞治療組、促紅細胞生成素治療組和聯(lián)合治療組神經功能的BBB評分均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且聯(lián)合治療組大鼠神經功能恢復明顯好于骨髓基質干細胞治療組和促紅細胞生成素治療組（P<0.05），見表1。

表1 各組大鼠各時間點后肢運動功能的BBB評分值 分

2.2 組織學變化 手術后1 d，對照組脊髓組織形態(tài)結構完好，神經細胞形態(tài)結構未見異常，沒有腫脹等改變，細胞核大且圓，核仁清晰；其余三組脊髓組織內有點狀或片狀出血區(qū)，一部分神經元腫脹、空泡形成，核偏位，核仁較清晰。手術后28 d對照組脊髓組織內部神經元很少，有明顯的空洞出現(xiàn)且形成大量瘢痕組織；骨髓基質干細胞治療組與促紅細胞生成素治療組的脊髓組織局部出現(xiàn)空洞，有一些神經元；聯(lián)合治療組脊髓組織內空洞及瘢痕組織不明顯，內含較多神經元，神經元胞體清楚、突起較多。

3 討論

該試驗中，筆者用BBB評分法對每只大鼠的神經功能情況進行評分，發(fā)現(xiàn)治療后的第7、14、21、28天，大鼠下肢的運動功能隨時間推移逐漸恢復，其中28 d時最為明顯。三個實驗組與對照組在第7、14、21、28天相比，差異均有統(tǒng)計學意義，EPO治療組與BMSCs治療組相比較，差異無統(tǒng)計學意義（P<0.05），聯(lián)合組比其余組大鼠后肢運動功能的恢復更明顯，表明聯(lián)合組治療效果更好。SCI后，神經纖維在損傷的部位開始發(fā)生變性，再向兩側發(fā)生變性，此過程持續(xù)兩到三周，其間纖維的變性和再生同時進行，神經功能的恢復不明顯。兩周起再生成為神經纖維變化的主要形式，神經功能的恢復開始明顯加快，實驗中BBB評分的結果證實了這一點。本實驗還發(fā)現(xiàn)對照組大鼠盡管未接受治療，但雙后肢運動功能BBB評分也逐漸增高，提示SCI后神經有一定的自我修復能力。本實驗治療后第28天，對照組脊髓組織內部神經元較少，有明顯的空洞出現(xiàn)且形成大量瘢痕組織，聯(lián)合治療組脊髓組織內空洞及瘢痕組織不明顯，內含較多神經元，EPO治療組與BMSCs治療組介于兩者之間?？赡芘cEPO減少細胞凋亡，促進神經發(fā)育以及BMSCs移植進入損傷部位替代死亡的神經細胞，吞噬壞死組織及癱痕，促進軸突再生有關。BMSCs受脊髓損傷處微環(huán)境的誘導，可分化為神經元樣細胞、少突膠質細胞和星形膠質細胞[12-13]；并分泌多種神經生長因子[14]，有效地促進軸突的再生，使受損傷的神經纖維得以修復，對損傷脊髓內的神經元具有保護和修復作用，修復或促進損傷局部生成新的血管和血管重建；同時還可誘導神經干細胞分化為神經細胞，提高神經干細胞的分化率和存活率[15]。BMSCs可從患者自身提取，排除了細胞移植面臨的免疫排斥、細胞來源和倫理道德限制，因此，BMSCs被認為是治療脊髓損傷的一種理想干細胞。研究表明，大鼠的骨髓基質干細胞能表達EPO受體，當EPO與該受體結合后，可以促使更多的骨髓基質干細胞進行分裂，生成大量的子細胞[16]。此外，研究顯示EPO能動員骨髓基質干細胞向脊髓受損部位移動，改善損傷部位的微環(huán)境，促進移植的BMSCS在體內存活及分化，從而分泌神經營養(yǎng)因子，促進神經修復，兩者共用具有協(xié)調作用[17]。本研究表明，聯(lián)合治療組大鼠的后肢運動功能恢復明顯好于其他實驗組，能明顯促進SCI后大鼠的神經功能恢復，說明骨髓基質干細胞移植聯(lián)合EPO治療脊髓損傷，兩者具有協(xié)同效應。這為臨床上應用BMSCs聯(lián)合EPO治療SCI提供了重要的理論依據(jù)和實驗基礎。

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（收稿日期：2014-07-11） （本文編輯：陳丹云）