利用母本來源的單倍體技術(shù)獲得雙抗TMV和PVY煙草株系

劉勇，陳學(xué)軍，肖炳光，李永平

云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,云南昆明圓通街33號 650021

利用母本來源的單倍體技術(shù)獲得雙抗TMV和PVY煙草株系

劉勇，陳學(xué)軍，肖炳光，李永平

云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,云南昆明圓通街33號 650021

為選育雙抗煙草花葉病毒（TMV）和馬鈴薯Y病毒（PVY）的煙草材料,采用Coker176與NC55雜交后代F1與非洲煙雜交獲得單倍體苗,經(jīng)過苗期抗性鑒定、分子標(biāo)記輔助選擇和葉脈培養(yǎng)加倍,獲得母本來源的雙抗TMV和PVY的雙單倍體。通過人工接種抗性鑒定、標(biāo)記檢測和田間株系比較,獲得抗性、植物學(xué)性狀穩(wěn)定的雙單倍體第三代種子。與常規(guī)雜交系統(tǒng)選育相比較,雙單倍體方法的獲得后代變異更大、性狀更容易穩(wěn)定。

非洲煙；單倍體；TMV；PVY；育種

煙草常規(guī)雜交育種由于性狀分離,需要經(jīng)過4～5代的連續(xù)選擇,才能獲得性狀穩(wěn)定的品系。理論上,加倍單倍體的純合只需要1個(gè)世代, 就能獲得性狀穩(wěn)定株系。因此,采用單倍體育種技術(shù),可明顯縮短育種年限[1]。煙草單倍體誘導(dǎo)有來源于雄配子和雌配子2條途徑,誘導(dǎo)來源于雄配子的單倍體的常用方法為花藥培養(yǎng),具有步驟簡便,單倍體苗易獲得等優(yōu)點(diǎn)[2]。采用花粉離體培養(yǎng)或者游離小孢子培養(yǎng)獲得雄核發(fā)育的單倍體也有報(bào)道[2]。但利用雄配子來源的單倍體育成的煙草品種存在產(chǎn)量降低等劣勢,美國等煙草育種先進(jìn)國家,并不采用雄配子來源的單倍體用于育種[3]。我國只有單育一號等幾個(gè)煙草品種曾在生產(chǎn)上推廣利用[4]。來源于雌配子的煙草單倍體育成的品種,無產(chǎn)量降低的劣勢[5]。采用未授粉子房、胚株離體培養(yǎng)可誘導(dǎo)來源于雌配子的單倍體植株[6],但步驟復(fù)雜,難以滿足育種的需求。利用遠(yuǎn)源雜交產(chǎn)生母本來源的單倍體,在玉米育種中應(yīng)用廣泛[7]。利用煙草野生種非洲煙（Nicotiana african）和烤煙雜交,產(chǎn)生母本來源的單倍體在美國育種應(yīng)用廣泛[8-9]。美國著名的烤煙品種NC71等,在選育過程中采用了母本來源的雙單倍體技術(shù)。煙草單倍體加倍常用秋水仙堿處理生長點(diǎn),存在加倍效率較低的問題[10]。葉脈組織培養(yǎng)加倍煙草單倍體,在美國應(yīng)用較早?？纤髮W(xué)的M.J.Kasperbauer等（1972）研究發(fā)現(xiàn),利用葉片中脈組織培養(yǎng)方法[11],可以獲得加倍單倍體植株,隨著篩選方法的提高,目前國外同行的單倍體葉脈培養(yǎng)加倍率已達(dá)到80%左右。

煙草馬鈴薯 Y病毒?。≒VY)和煙草花葉?。═MV）是危害煙草的重要病毒病害,通常混合發(fā)生[12]。煙草種質(zhì)資源中,已鑒定出攜帶抗PVY基因va的煙草種質(zhì)NC55[13]和攜帶抗TMV基因N的煙草種質(zhì)Coker176[14]。但缺乏雙抗PVY和TMV的煙草抗源。本文采用組合F1與非洲煙雜交產(chǎn)生母本來源的單倍體,苗期接種篩選抗病株,利用葉脈組織培養(yǎng)加倍等技術(shù),獲得雙抗TMV和PVY的煙草育種中間材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

煙 草 種 質(zhì) Coker176（ 抗 TMV）、 NC55（ 抗PVY）和非洲煙（N.african）由本院提供。TMV和PVY毒源分別在防蟲網(wǎng)室內(nèi)繁殖保存。

1.2 雜交組合配制

利用常規(guī)方法配制Coker176和NC55的F1雜交組合。F1在塑料大棚內(nèi)移栽,開花時(shí),人工去雄,取非洲煙的花粉授粉。授粉后套袋,單株收種得到種子（F1-Naf）。去雄、授粉和收種要仔細(xì)操作,防止污染。

1.3 單倍體苗挑選與抗性鑒定

在塑料盤或育苗盤上密集播種F1-Naf。煙苗2片真葉時(shí),用牙簽標(biāo)記類似單倍體的單株。煙苗4-5片真葉時(shí),再次挑選類似單倍體的煙苗盆栽,成活后,混合接種TMV病葉汁液1000倍和PVY病葉汁液100倍。定期調(diào)查病害癥狀。篩選抗病的苗,淘汰感病苗。同時(shí)采用N基因[15]和Va基因的分子標(biāo)記[16],檢測驗(yàn)證類似單倍體苗的抗性。

1.4 葉脈組織培養(yǎng)加倍

開花時(shí)根據(jù)花的形態(tài)和是否結(jié)實(shí),在抗病單株中挑選單倍體植株的中部葉片,取中脈組織培養(yǎng)。方法為：取主脈約鉛筆粗細(xì)的中部葉片,剪取葉基部約5 cm長主脈,用自來水沖洗干凈。用75﹪乙醇消毒1 min,無菌水沖洗2次,再用0.1﹪升汞消毒10 min,無菌水沖洗5～6次,將主脈切成小段。接種到MS+2.0 mg/L KT +0.2 mg/L NAA的培養(yǎng)基上誘芽,待芽長到2 cm高時(shí),接種到1/2 MS培養(yǎng)基+IBA 0.5 mg/L中誘根培養(yǎng),煙苗3 cm高時(shí),假植至漂浮盤中,成活后盆栽或移栽大田。開花后選取可育單株套袋留種。對來源于同一個(gè)單倍體的加倍單株混合收種（DH1）。

1.5 加倍單株抗性鑒定與農(nóng)藝性狀觀察

對雙單倍體第1代材料(DH1),每份盆栽60株左右,苗期人工混合接種TMV和PVY,方法同上。調(diào)查發(fā)病情況,驗(yàn)證抗性是否穩(wěn)定。對雙單倍體第1代和第2代材料（DH2）進(jìn)行株系比較試驗(yàn),方法為大田雙行區(qū)移栽60株,初步觀察植物學(xué)性狀和農(nóng)藝性狀,挑選表現(xiàn)較好的單株留種。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙抗TMV與PVY單倍體單株的獲得與加倍

在Coker176（抗TMV）與NC55（抗PVY）的雜交的F1植株上,用非洲煙花粉授粉,2009年8月獲得雜交種子（F1-Naf）。2009年9月播種,挑選出類似單倍體的煙苗約20株。苗期混合接種TMV/PVY,根據(jù)接種后第5 d至開花期的病害調(diào)查結(jié)果,篩選出3株雙抗的單倍體和1株單抗TMV的單倍體（表1）。與PVY抗性相關(guān)的Va標(biāo)記和與TMV抗性相關(guān)的N基因標(biāo)記檢測結(jié)果表明（表1）,3個(gè)雙抗單株攜帶分別來源于雙親的va位點(diǎn)和N基因。通過葉脈組織培養(yǎng)加倍,2010年底獲得雙單倍體種子（雙單倍體第1代株系（DH1））。

表1 單倍體苗抗性鑒定與標(biāo)記檢測Tab.1 Haploid seedlings resistance identification and marker detection

2.2 雙單倍體第1代株系抗性鑒定與性狀觀察

2011年防蟲溫室內(nèi),每個(gè)雙單倍體株系盆栽60株的苗期抗性鑒定結(jié)果表明：接種后5 d,3個(gè)株系的單株全部表現(xiàn)TMV枯斑；接種后21 d調(diào)查,V8-N2和V9-N2的PVY發(fā)病率為0,V9-N1的PVY發(fā)病率為6.35%（表2）。表明3個(gè)雙單倍體第1代株系的對TMV和PVY的抗性穩(wěn)定。大田株系比較試驗(yàn)表明,雙單倍體株系間的植物學(xué)性狀和農(nóng)藝性狀出現(xiàn)較明顯的分離（表3）。V8-N2株系的葉片數(shù)少,葉片窄；V9-N1和V9-N2株系現(xiàn)蕾期的株高、葉型出現(xiàn)明顯的寬葉與窄葉分離,挑選株型較好的單株留種,獲得雙倍體第2代（DH2）種子。

表2 雙單倍體第1代株系抗性鑒定Tab.2 Resistance identification of first generation double-haploid lines

表3 雙單倍體第1代株系的植物學(xué)與農(nóng)藝性狀Tab.3 The botanical and agronomic traits of first generation double-haploid lines

2.3 雙單倍體第2代株系比較

2012年大田株系比較試驗(yàn)表明,雙單倍體第2代株系的植物學(xué)性狀和農(nóng)藝性狀出現(xiàn)趨于穩(wěn)定（表4）。其中V9N2-12和V9N2-13與對照品種NC55的畝產(chǎn)量相當(dāng),在這兩個(gè)株系中挑選株型較好的單株留種,獲得雙倍體第3代（DH3）種子。

表4 雙單倍體第2代株系的植物學(xué)與農(nóng)藝性狀Tab.4 The botanical and agronomic traits of second generation double-haploid lines

2.4 雙單倍體抗病育種的特點(diǎn)

以聚合TMV抗性（Coker 176的N基因）和NC55的PVY抗性（va位點(diǎn)）為例,雙單倍體方法和常規(guī)雜交方法的程序差異較大（表5）。采用冬季加代,從F1種子開始至獲得雙抗且抗性純合的種子,兩種方法均需要18個(gè)月左右時(shí)間。雙單倍體方法的工作量主要為配制F1與非洲煙雜交的種子、單倍體苗獲得和單倍體加倍,技術(shù)難點(diǎn)為單倍體苗獲得和加倍。常規(guī)雜交方法的工作量主要為F2抗病單株篩選和F3測交。雙單倍體株系的抗性和農(nóng)藝性狀相對穩(wěn)定,獲得性狀穩(wěn)定的品系預(yù)計(jì)可比常規(guī)雜交方法縮短1～2年。雙單倍體株系之間的葉片數(shù)和葉片大小等性狀的變異較大。

表5 雙單倍體與常規(guī)育種的程序比較Tab.5 Comparison between double-haploid disease-resistance breeding methods and conventional disease-resistance breeding methods

3 結(jié)論與討論

雙單倍體方法在聚合兩種或多種抗性方面,具有后代目標(biāo)性狀容易穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn),但同時(shí)存在技術(shù)較為復(fù)雜,獲得單倍體和單倍體加倍的難度較大的問題,可通過增加F1與非洲煙的雜交種子數(shù)量及采用流式細(xì)胞儀輔助篩選單倍體的方法加以解決。本文采用葉脈培養(yǎng)加倍方法,該方法具有加倍效率較高的優(yōu)點(diǎn),但從葉脈培養(yǎng)至獲得種子,需要12個(gè)月左右的時(shí)間。通過采用苗期鑒定單倍體苗,秋水仙堿處理腋芽[17]等加倍方法,預(yù)計(jì)可縮短加倍時(shí)間7個(gè)月左右。

致謝：感謝楊華兵和楊彥明在溫室管理和組織培養(yǎng)中的幫助。

[1]佟道儒.煙草育種學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,1997：466-469.

[2]朱惠琴, 戴文新.煙草加倍單倍體群體的構(gòu)建及其在遺傳育種中的應(yīng)用[J].青海大學(xué)學(xué)報(bào)( 自然科學(xué)版),2003,21(6):20-23.

[3]任學(xué)良, 李繼新, 李明海.美國煙草育種進(jìn)展簡況[J].中國煙草學(xué)報(bào), 2007,13(6):57-64.

[4]佚名.煙草單倍體育種[J].農(nóng)業(yè)科技通訊, 1978,7:1.

[5]冉邦定.從未受精的煙草胚珠誘導(dǎo)出單倍體植株[J].中國煙草, 1980,3:25-26.

[6]祝仲純, 吳海珊, 安慶坤.大葉黃煙未傳粉子房培養(yǎng)及其細(xì)胞學(xué)研究[J].遺傳學(xué)報(bào), 1984, 11(4) : 281- 287.

[7]杜何為, 戴景瑞, 李建生.玉米單倍體育種研究進(jìn)展[J].玉米科學(xué), 2010, 18(6): 1-7.

[8]Burk L G, Gerstel D U, Wernsman E A.Maternal haploids ofNicotiana tabacumL.from seed[J].Science.1979,206:585

[9]Daryl T Bowman , Verne Sisson.A historical overview of flue-cured tobacco breeding in the USA[J].Tobacco Science, 2000, 44:59-64

[10]戴 冕, 呂華玉, 邵秀梅.煙草花粉胚狀體染色體加倍的研究[J].作物學(xué)報(bào), 1984, 10( 1) : 19-23.

[11]Kasperbauer M J, Collins G B.Reconstitution of diploids from leaf tissue of anther-derived haploid in tobacco[J].Crop Science, 1972,12: 98-101.

[12]朱賢朝,王彥亭,王智發(fā).中國煙草病害[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社, 2002:209-216.

[13]林志文,劉勇,李梅云,等.煙草種質(zhì)資源抗馬鈴薯Y病毒病鑒定方法比較[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2010,26(19):269-274.

[14]解芬, 肖炳光, 高玉龍, 等.煙草品種Coker176和Ti245抗TMV的遺傳分析[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,25(2):170-172,182.

[15]Lewis R S, Milla S R, Levin J S.Molecular and genetic characterization ofNicotiana glutinosaL.chromosome segements in tobacco mosaic virus-resistant tobacco accessions[J].Crop Science, 2005, 45(6):2355-2362.

[16]王貴,劉勇,盧秀萍,等.煙草PVY抗性的遺傳分析與分子標(biāo)記篩選[J].分子植物育種, 2012,10(1):97-103.

[17]佚名.煙草單倍體育種技術(shù)的研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),1975:1:50-58.

Tobacco lines resistant to TMV and PVY obtained by maternal-derived haploid breeding methods

LIU Yong,CHEN Xuejun,XIAO Bingguang,LI Yongping
Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Science, Kunming 650021, China

Doubled haploid (DH) technique can accelerate traits stabilization in hybridization offspring.In the breeding of variety resistant to Tobacco mosaic virus (TMV) and Potato virus Y (PVY), haploids were obtained from F1hybrids between Coker176 and NC55 crossing as female toNicotiana african.TMV and PVY resistant haploids were selected by seedling resistance identification and molecular marker test.DH plants were regenerated from leaf mid-vein culture method.Artificial inoculated resistance evaluation, markers detection, and field comparison were conducted.The third generation seed of DH lines which showed stable resistance and botanical characters were harvested.Compared to conventional hybrid breeding methods, DH breeding method showed greater variation between offspring lines and objective traits were relatively more stable.

Nicotiana african;haploid; breeding

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.03.014

S435.72 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1004-5708（2014）03-0084-05

中國煙草總公司云南省公司科技項(xiàng)目（2010YN01,2012YN02）;云南省社會(huì)發(fā)展科技計(jì)劃（2010CD127）

劉勇（1970—）,博士,副研究員,主要從事煙草病害防治與抗病育種研究,Tel：0871-65106352,Email: yliu@yntsti.com

李永平（1967—）,碩士,研究員,主要從事煙草育種研究,Email: liyongping@yntsti.com

2013-06-03