貴州省某規(guī)模化豬場(chǎng)暴發(fā)豬偽狂犬病與大腸桿菌混合感染的診斷

李 達(dá)，湯德元，李春燕，羅險(xiǎn)峰，曾智勇，劉 建，郝 飛，王洪光

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽(yáng) 550008）

2014年3月，貴州省開陽(yáng)縣某規(guī)?；i場(chǎng)送檢斷奶仔豬10頭，其中4頭死亡，6頭病危，1 d后其余病危的6頭相繼死亡。為了了解該豬場(chǎng)疫病的感染狀況，對(duì)該規(guī)?；i場(chǎng)送檢的發(fā)病仔豬進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀觀察、病理剖檢、細(xì)菌學(xué)和PCR技術(shù)診斷，確診為豬偽狂犬病和豬大腸桿菌混合感染。報(bào)告如下。

1 流行病學(xué)調(diào)查

該豬場(chǎng)斷奶仔豬未免疫豬偽狂犬病疫苗，發(fā)病突然，1～3 d共計(jì)有80頭斷奶仔豬發(fā)病，死亡36頭，病豬發(fā)熱，體溫升高到40.0℃～41.0℃，精神沉郁，食欲不振，喘氣，被毛粗亂，血液稀薄。發(fā)病后豬場(chǎng)曾使用青霉素、鏈霉素等抗生素進(jìn)行治療，病豬體溫有所降低，但發(fā)病后2～3 d死亡。

2 臨床癥狀及剖檢病理變化

病豬主要癥狀是脫水和下痢，黃痢仔豬排黃色稀便，急性病例不見癥狀而昏迷死亡。白痢仔豬排出乳白色漿液狀、糊狀糞便。隨著病情的發(fā)展，出現(xiàn)食欲廢絕，有的眼屎多、眼瞼紅腫，眼圈發(fā)紫、結(jié)膜潮紅，有的病豬尖叫、磨牙，有的病豬耳朵發(fā)青、發(fā)紫、身體發(fā)紺，有的病豬出現(xiàn)呼吸困難，最后窒息死亡。

剖檢病理可見喉頭、扁桃體充血、皮下組織水腫；腸系膜淋巴結(jié)和下領(lǐng)淋巴結(jié)充血、腫大，間有出血；肺部有局灶性炎癥，并伴有充血、出血、淤血條紋和水腫，切開有泡沫；肝臟邊緣呈紫黑色、表面有許多散在的、顆粒狀大小不一的白色壞死斑點(diǎn)；腎臟表面有針尖大小出血點(diǎn)，腎臟切面有散在壞死點(diǎn)。

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

3.1 豬偽狂犬病ELISA初步檢測(cè)血樣 應(yīng)用豬偽狂犬病ELISA試劑盒對(duì)抽取的10份血清進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明，由于該規(guī)?；i場(chǎng)未接種偽狂犬病疫苗，根據(jù)送檢的10頭仔豬血樣采集進(jìn)行的ELISA檢測(cè)陽(yáng)性率達(dá)80%，從而初步診斷該規(guī)模化豬場(chǎng)存在PRV感染。

3.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)及形態(tài)觀察 無(wú)菌采集取病死豬的肝、肺、腎、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)病料同時(shí)進(jìn)行接種普通瓊脂平板、血液瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基上，置于含有5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)24～48 h后。淋巴結(jié)接種在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上形成直徑約2 mm的圓形、光滑、隆起、濕潤(rùn)、半透明淡灰色的菌落；在麥康凱培養(yǎng)基上生長(zhǎng)成較大的呈光滑、濕潤(rùn)、圓形、隆起的粉紅色菌落，部分菌株在血液瓊脂平板上呈β溶血環(huán)。用接種棒挑取可疑菌落制成涂片進(jìn)行革蘭染色，通過(guò)涂片鏡檢為兩端鈍圓的短小桿菌，偶有2～3個(gè)菌體相連，為革蘭陰性桿菌，符合大腸桿菌形態(tài)特性。

3.3 生化特性鑒定 將細(xì)菌純培養(yǎng)物接種于微量生化鑒定管中，置于含有5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h后，生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果表明，該分離株對(duì)硫化氫、苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽、枸櫞酸鹽、尿素、半固體、賴氨酸、鳥氨酸、氨基酸對(duì)照、棉子糖、側(cè)金盞花醇、木膠糖12種發(fā)酵管反應(yīng)呈陽(yáng)性，對(duì)葡磷胨水、山梨醇2種發(fā)酵管反應(yīng)呈陰性。其他生化試驗(yàn)中，吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性，V-P試驗(yàn)陰性，枸櫞酸酸鹽利用試驗(yàn)呈陰性，七葉苷水解試驗(yàn)呈陽(yáng)性，均符合大腸桿菌生化特性。

3.4 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)采用世界衛(wèi)生組織推薦的標(biāo)準(zhǔn)紙片瓊脂擴(kuò)散法（disc agar diffusion），即（K-B法）操作。用接種環(huán)挑取1～2環(huán)純培養(yǎng)的分離菌，接種于含5%脫纖綿羊血的M-H瓊脂培養(yǎng)基上涂勻，選取12種常用藥敏紙片均勻地貼到培養(yǎng)基上，置于含有5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h后觀察結(jié)果，測(cè)定抑菌圈直徑。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，從該豬場(chǎng)分離的病原菌對(duì)頭孢唑啉、阿莫西林、慶大霉素和利福平高敏；對(duì)鏈霉素和妥布霉素中敏；而對(duì)氧氟沙星、諾氟沙星和四環(huán)素已經(jīng)產(chǎn)生了耐藥性。

3.5 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 取血液瓊脂平板上培養(yǎng)的24 h菌落制成細(xì)菌懸液(CFU為5×108個(gè)∕mL)，分別取0.5 mL采取腹腔注射接種在生長(zhǎng)條件相同的10只小鼠，對(duì)照組10只注射等量生理鹽水。結(jié)果接種了分離菌的小鼠均在24～48 h內(nèi)死亡，對(duì)照組沒有死亡。無(wú)菌取死亡小鼠的心臟、肝臟、淋巴結(jié)和脾臟等組織接種在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上，結(jié)果經(jīng)分離提純后鑒定，與以上特性相一致,確診為有大腸桿菌參與的混合感染。

3.6 PCR檢測(cè) 根據(jù)GenBank中PRV GDSH株（E F552427）和Guizhou-DY株（JX417716）的糖蛋白gE基因主要抗原表位序列，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物（P1、P2），預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為652 bp，擴(kuò)增引物序列為（下劃線表示限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)）：P1：5′-CGGGATCCGCCGACGACGATGACCTCAAC-3′，P2：5′-CGGAATTCCAGCGTGGCGGTAAAGTTCTC-3′。PCR反應(yīng)采用25 μL體系：其中ddH2O 5 μL，2×GC BufferⅠ12.5 μL，dNTP 4.0 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，Taq酶0.5 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃4 min；95℃1.5 min，58℃0.5 min，72℃1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。對(duì)疑似PRV感染的病料進(jìn)行提取病毒總DNA（按照DNA試劑盒上說(shuō)明書進(jìn)行提?。?jīng)PCR擴(kuò)增后通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳得到1條652 bp的片段，陰性對(duì)照未見條帶（見圖1）。測(cè)序后與預(yù)期結(jié)果相符，這說(shuō)明送檢的病料確診為有PRV的混合感染。

4 討論

通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀觀察、病理剖檢診斷及豬偽狂犬病ELISA檢測(cè)，初步診斷該規(guī)?；i場(chǎng)斷奶仔豬疑似豬偽狂犬病病毒和大腸桿菌混合感染。通過(guò)進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化特性、培養(yǎng)特性及動(dòng)物致病性試驗(yàn)鑒定確診該細(xì)菌為大腸桿菌。PCR結(jié)果顯示，送檢病豬中檢出了PRV核酸陽(yáng)性條帶，測(cè)序后與預(yù)期結(jié)果相符，均為PRV，并且該規(guī)?；i場(chǎng)斷奶仔豬并沒有接種豬偽狂犬病病毒疫苗，表明該豬場(chǎng)已經(jīng)存在PRV感染。綜合分析以上結(jié)果，建議該規(guī)?；i場(chǎng)緊急接種豬偽狂犬病病毒疫苗，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理并合理投喂抗生素避免繼發(fā)感染，同時(shí)將可疑豬和病豬全部隔離飼養(yǎng)，病死豬及污染物則徹底焚燒或深埋，對(duì)污染的圈舍和四周環(huán)境進(jìn)行嚴(yán)格消毒，患病豬群則隔離治療并帶豬消毒，對(duì)新購(gòu)進(jìn)豬要進(jìn)行嚴(yán)格的隔離、檢疫，隔離期間定期進(jìn)行血清學(xué)抗體檢測(cè)。藥敏試驗(yàn)表明，該豬場(chǎng)在治療時(shí)可將頭孢唑啉、阿莫西林、慶大霉素和利福平作為治療仔豬大腸桿菌病的首選藥物。對(duì)于混合或多重繼發(fā)感染的情況，應(yīng)當(dāng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)癥下藥，避免亂用藥而造成的仔豬的死亡。豬偽狂犬病病毒與大腸桿菌混合感染多表現(xiàn)為急性、發(fā)病快、病程短、死亡率高，一旦發(fā)病，將帶來(lái)很大的經(jīng)濟(jì)損失，加上現(xiàn)在血清型眾多、現(xiàn)有疫苗效果較差、抗菌藥物的大量使用，大腸桿菌在選擇壓力下廣泛的產(chǎn)生耐藥性。因此，規(guī)?；i場(chǎng)只有建立健全獸醫(yī)衛(wèi)生防疫制度，搞好日常衛(wèi)生管理工作，嚴(yán)格引種，堅(jiān)持自繁自養(yǎng)，“全進(jìn)全出”，合理使用預(yù)防藥物等綜合防制措施，才能最大限度的減少疫病的發(fā)生。