豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的臨床應(yīng)用研究

徐 璐，范學(xué)政，梁智選，陳 靜，余 勇，熊仲良，吳赟竑，寧宜寶，鄭 然，趙啟祖，王 琴

（1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 海淀 100081；2.天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，天津 北辰 300402；3.山東省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山東 濟(jì)南 250022；4.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041；5.重慶市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，重慶 渝北 401120；6.浙江省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，浙江杭州 310020）

豬瘟為我國的重大動(dòng)物疫病。在《國家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃（2012-2020年）》中，將豬瘟作為我國優(yōu)先防治和重點(diǎn)防范的16種動(dòng)物疫病之一。我國對(duì)豬瘟防控主要采用豬瘟疫苗免疫加捕殺的策略，而抗體檢測(cè)是免疫效果評(píng)價(jià)的主要手段。目前，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織推薦的豬瘟抗體檢測(cè)方法是ELISA檢測(cè)方法和熒光抗體中和試驗(yàn)Fluorescent antibody virus neutralisation test，F(xiàn)VNT）[1]，而FVNT對(duì)試驗(yàn)條件和操作人員的要求很高，且耗時(shí)長(zhǎng)，僅適合專業(yè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行少量樣本檢測(cè)，不宜推廣應(yīng)用。因此可以說，ELISA方法是目前國際上承認(rèn)的惟一適合大規(guī)模應(yīng)用的血清檢測(cè)方法。在進(jìn)行ELISA檢測(cè)方法評(píng)價(jià)時(shí)，最重要的兩個(gè)指標(biāo)就是敏感性和特異性，而二者又存在一定的矛盾性。當(dāng)對(duì)一種檢測(cè)方法的敏感性要求較高時(shí)，勢(shì)必會(huì)損失一部分特異性；同樣，當(dāng)特異性要求較高時(shí)，勢(shì)必會(huì)損失一部分敏感性。因此，對(duì)于一個(gè)好的檢測(cè)方法來說，一定要尋找敏感性和特異性最佳的平衡點(diǎn)和結(jié)合點(diǎn)[2-4]。目前，用于豬瘟抗體檢測(cè)的ELISA方法主要有液相阻斷ELISA和間接ELISA兩種原理。液相阻斷ELISA使用了單克隆抗體，因此檢測(cè)的特異性更高；而間接ELISA則更側(cè)重于敏感性。因此，為了研究豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的臨床應(yīng)用效果，采用該試劑盒和進(jìn)口阻斷試劑盒對(duì)田間采集的臨床血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)采用OIE推薦的FVNT進(jìn)行符合驗(yàn)證，幫助讀者在實(shí)際工作中選擇更為合適的檢測(cè)試劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 PK15傳代細(xì)胞系、豬瘟病毒Thiveral株由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保存并提供。

1.1.2 豬瘟病毒單克隆熒光抗體 由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保存并提供。

1.1.3 試劑盒 豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒（簡(jiǎn)稱“間接試劑盒”）中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，批號(hào)為20130524。豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑盒（簡(jiǎn)稱“阻斷試劑盒”）：批號(hào)為A651，購自美國IDEXX公司。

1.1.4 血清樣本 臨床血清樣本1 621份，分別采自四川省、重慶市、山東省、天津市、浙江省的種豬場(chǎng)、商品豬場(chǎng)和散養(yǎng)戶（見表1）。其中，經(jīng)豬瘟疫苗免疫豬血清1 245份，非免疫仔豬血清376份（見表2）。

表1 臨床樣本來源統(tǒng)計(jì)

表2 臨床血清樣本免疫狀況統(tǒng)計(jì)

1.2 方法

1.2.1 ELISA試劑盒檢測(cè) 采用上述兩種試劑盒分別對(duì)1 621份田間血清進(jìn)行檢測(cè)，每份血清重復(fù)2孔，檢測(cè)步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。計(jì)算兩種試劑盒的符合率，結(jié)合血清的免疫背景，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.2 熒光抗體病毒中和試驗(yàn) 將上述兩種ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果有差異的血清用FVNT進(jìn)行驗(yàn)證，具體操作方法參見《陸生動(dòng)物診斷試劑和疫苗手冊(cè)》[1]。比較兩種試劑盒在檢測(cè)田間樣本時(shí)與FVNT的符合率。

2 結(jié)果

2.1 兩種試劑盒的檢測(cè)結(jié)果及符合率 在臨床檢測(cè)的1 621份豬血清樣本中，用間接試劑盒檢測(cè)出1 020份陽性，531份陰性，70份可疑；用阻斷試劑盒檢測(cè)916份陽性，628份陰性，77份可疑。檢測(cè)結(jié)果不相符的樣本為355份，其中有216份血清的檢測(cè)結(jié)果相反（一種試劑盒為陽性，另一種為陰性），另有139份血清的檢測(cè)結(jié)果存在可疑結(jié)果。兩種試劑盒的總符合率為78.1%（見表3）。

表3 間接試劑盒與阻斷試劑盒符合率統(tǒng)計(jì)

2.2 熒光抗體病毒中和試驗(yàn)（FVNT）對(duì)兩種試劑盒檢測(cè)結(jié)果不符合血清的驗(yàn)證 在上述兩種試劑盒檢測(cè)結(jié)果不符合樣本355份血清樣本中，從中選出283份足量血清，采用FVNT方法進(jìn)行驗(yàn)證性檢測(cè)，比較FVNT與兩種試劑盒的符合率（見表4和表5）。結(jié)果間接試劑盒與FVNT的符合率為69.26%，阻斷試劑盒與FVNT的符合率為28.62%。FVNT檢測(cè)結(jié)果代表性圖片見中插彩版圖1～4（其他血清照片略）。

圖1 Thiveral株病毒接毒對(duì)照

圖2 未接毒細(xì)胞對(duì)照

圖3 非免疫血清

圖4 免疫血清

表4 間接試劑盒與FVNT的符合率

表5 阻斷試劑盒與FVNT的符合率

中插彩版圖1為Thiveral豬豬瘟病毒接毒對(duì)照；中插彩版圖2為未豬瘟病毒細(xì)胞對(duì)照；中插彩版圖3為非免疫血清，樣本中無豬瘟病毒抗體，與豬瘟病毒Thiveral株不發(fā)生中和反應(yīng)，因此病毒能感染PK-15細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后用豬瘟病毒熒光抗體進(jìn)行染色，感染細(xì)胞出現(xiàn)特異性熒光（胞漿染色）；中插彩版圖4為免疫血清，樣本中含豬瘟病毒抗體，與豬瘟病毒Thiveral株發(fā)生中和反應(yīng)，使病毒喪失了對(duì)細(xì)胞的感染能力，經(jīng)培養(yǎng)后用豬瘟病毒熒光抗體進(jìn)行染色，在細(xì)胞中觀察不到特異性熒光。

2.3 間接試劑盒與阻斷試劑盒對(duì)免疫和非免疫血清的檢測(cè)結(jié)果 在1 621份臨床血清樣本中，有免疫血清1 245份，非免疫仔豬血清376份。在1 245份免疫血清中，間接試劑盒檢測(cè)出陽性1 008份，陽性率為80.96%（見表6）；阻斷試劑盒檢出陽性835份，陽性率為67.07%。在376份非免疫血清中，間接試劑盒檢出陰性323份，陰性率為85.9%；阻斷試劑盒檢出陰性296份，陰性率為78.72%（見表7）。

表6 間接試劑盒對(duì)臨床樣本檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

表7 阻斷試劑盒對(duì)臨床樣本檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

3 討論

豬瘟在我國屬重大動(dòng)物疫病。豬瘟疫苗為強(qiáng)制免疫疫苗。農(nóng)業(yè)部規(guī)定，每年的春季和秋季都要集中進(jìn)行免疫防疫，規(guī)模豬場(chǎng)和散養(yǎng)戶必須按照規(guī)定的免疫程序進(jìn)行全群免疫，而對(duì)免疫抗體水平監(jiān)測(cè)是免疫效果評(píng)價(jià)的惟一手段。在農(nóng)業(yè)部頒布的2010-2013年國家動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)方案中，規(guī)定可以采用阻斷ELISA或間接ELISA等方法進(jìn)行豬瘟抗體水平檢測(cè)。因此說明，阻斷ELISA和間接ELISA在實(shí)際應(yīng)用過程中，均具有合理性。但是針對(duì)我國的大規(guī)模強(qiáng)制免疫現(xiàn)狀，如何在不同的應(yīng)用范圍選擇適合的試劑盒就成為一個(gè)重要問題。

3.1 試劑盒研制原理的差異 阻斷試劑盒基于液相阻斷原理[5]，反應(yīng)孔的顏色深淺與血清中的抗體含量成反比。阻斷ELISA采用了單克隆抗體檢測(cè)，可大大提高檢測(cè)的特異性，但實(shí)際檢測(cè)的對(duì)象卻只是針對(duì)單一表位的抗體。因此，當(dāng)陽性血清中針對(duì)該表位抗體豐度不高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)的敏感性降低。

間接試劑盒基于間接ELISA原理[5]，反應(yīng)孔顏色深淺與結(jié)合在反應(yīng)板中的特異性抗體的量成正比。由于間接ELISA檢測(cè)的是針對(duì)包被抗原蛋白的多克隆抗體，因此會(huì)提高檢測(cè)的敏感性；但如果包被抗原的特異性或純化工藝不高，會(huì)導(dǎo)致較嚴(yán)重的非特異性反應(yīng)，影響檢測(cè)的特異性。

在進(jìn)行田間大規(guī)模普查時(shí)，需要對(duì)某一地區(qū)，某一群體的整體免疫狀況進(jìn)行分析，因此對(duì)檢測(cè)方法的敏感性要求較高。而針對(duì)某一規(guī)?；i場(chǎng)來說，尤其是種豬場(chǎng)，需要對(duì)每頭動(dòng)物的抗體水平進(jìn)行檢測(cè)評(píng)價(jià)的同時(shí)，還要排除其他疫病陽性抗體的干擾，因此對(duì)檢測(cè)方法的特異性要求較高。因此，上述兩種ELISA檢測(cè)方法具有各自的優(yōu)勢(shì)和局限性，在實(shí)際應(yīng)用過程中，一定要對(duì)試劑盒的質(zhì)量進(jìn)行嚴(yán)格的甄選，并且根據(jù)實(shí)際應(yīng)用對(duì)象選擇適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法。

3.2 兩種試劑盒與FVNT符合率差異 熒光抗體病毒中和試驗(yàn)（FVNT）是OIE推薦方法，為豬瘟抗體檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。此次試驗(yàn)所采用的豬瘟病毒熒光抗體為單克隆熒光抗體，引自英國AHVLA實(shí)驗(yàn)室，能夠識(shí)別我國所有流行的豬瘟毒株[7]，該株熒光單抗的使用，大大的提高了FVNT方法的敏感性與特異性。本次臨床試驗(yàn)對(duì)兩種ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果存在差異的283份血清樣本采用FVNT的方法進(jìn)行了確認(rèn)檢測(cè)，結(jié)果顯示，間接試劑盒與FVNT的符合率為69.26%，阻斷試劑盒與FVNT的符合率為28.62%。不符合樣本的確認(rèn)結(jié)果表明，間接試劑盒能更真實(shí)地反映疫苗免疫后的中和抗體水平，而阻斷試劑盒對(duì)陽性血清存在明顯的漏檢狀況。

3.3 兩種試劑盒檢測(cè)結(jié)果與免疫背景之間的關(guān)系 豬瘟在田間的感染和流行情況較為復(fù)雜。在某些豬瘟流行地區(qū)，豬瘟疫苗免疫失敗的情況比較常見。因此，田間采集的免疫血清中存在陰性血清。另外，某些仔豬會(huì)可能由于感染等原因產(chǎn)生豬瘟抗體，因此非免疫仔豬血清中也會(huì)有部分陽性血清。雖然存在一些不確定因素，但總體來說，一個(gè)地區(qū)的免疫狀況基本能夠反映該地區(qū)豬群的整體免疫水平。在此次的臨床試驗(yàn)中，間接試劑盒和阻斷試劑盒對(duì)免疫血清檢測(cè)的陽性率分別為80.96%和67.07%，說明在臨床的免疫血清中，確實(shí)存在一部分豬瘟抗體陰性血清；而對(duì)非免疫血清的陰性率檢測(cè)結(jié)果分別為85.9%和78.72%，說明臨床的非免疫血清中，存在陽性血清。因此對(duì)于田間采集的臨床樣本來說，如果以臨床樣本的免疫背景作為參考依據(jù)，間接試劑盒的敏感性和特異性均優(yōu)于阻斷試劑盒。

3.4 兩種試劑盒檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生差異的原因 在對(duì)1 621份田間樣本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，兩種試劑盒的總符合率為78.1%，較實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果低7.97%[6]。通過對(duì)各個(gè)地區(qū)的符合率結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，不同試驗(yàn)地區(qū)的符合率存在較大差異，最高為83.67%，最低僅為71.47%。從上述結(jié)果可以看出，由于各地區(qū)免疫狀況復(fù)雜，不同地區(qū)豬群的抗體水平差異很大，導(dǎo)致臨床試驗(yàn)中兩種試劑盒的符合率也存在很大差異。而實(shí)驗(yàn)室研究中所檢測(cè)的血清樣本均采自生產(chǎn)狀況良好、管理規(guī)范的規(guī)模化豬場(chǎng)，并且所有血清均經(jīng)過FVNT方法的定性檢測(cè)，因此實(shí)驗(yàn)室符合試驗(yàn)用陽性血清的抗體水平相對(duì)較高，檢測(cè)結(jié)果更加容易判斷。另外，不同地區(qū)、不同實(shí)驗(yàn)室人員的操作水平也是影響試劑盒符合率的一個(gè)重要原因。

4 結(jié)論

通過大量的田間試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在我國豬瘟疫苗強(qiáng)制免疫的政策下，選擇豬瘟病毒間接ELISA抗體試劑盒更適合我國實(shí)際情況。

[1]世界動(dòng)物衛(wèi)生組織.陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)（哺乳動(dòng)物、禽鳥與蜜蜂）[M].5版.農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局／中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，譯.2004．

[2]王駿，吳虹橋，宋兆琪，等.受試者作業(yè)特征曲線（ROC）及其在影像學(xué)中的應(yīng)用[J].放射學(xué)實(shí)踐，2000,15(3):201-202.

[3]杜雅麗，李道帆，李靜，等.用ROC曲線評(píng)價(jià)心血管病危險(xiǎn)因素聚集的相關(guān)因素及適宜切點(diǎn)的確定[J].廣東醫(yī)學(xué)，1999,24(9):993-995.

[4]陳衛(wèi)中，倪宗瓚，潘曉平，等.用ROC曲線確定最佳臨界點(diǎn)和可疑值范圍[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2005，32（7）：729-731.

[5]John R.Crowther,the ELISA guide book，Humana Press[M].2001.

[6]徐璐，范學(xué)政，徐和敏，等.豬瘟抗體間接ELISA檢測(cè)試劑盒的研制和應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)雜志，2012，48(9):21-24.

[7]Zhu Y，Shi Z，Drew T W，et al.Antigenic differentiation of classical swine fever viruses in China by monoclonal antibodies[J].Virus Res，2009，42（1-2）:169-174.