RT-LAMP檢測雞傳染性支氣管炎病毒方法的建立及應(yīng)用

鮮思美，楊 鈺，汪德生，劉 嬡，尹強軍，鄧 詩，蘇 剛，孔維祥

（1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省動物疫病研究所，貴州 貴陽 550025）

雞傳染性支氣管炎（Infectious Bronchitis，IB）是由冠狀病毒科（Coronavriridge）冠狀病毒屬（Coronavirus)的傳染性支氣管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus，IBV）引起雞的一種急性、高度接觸性呼吸道傳染病。主要侵害雞的呼吸系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)和消化系統(tǒng)，已發(fā)現(xiàn)呼吸型、腎型、腸型等多種致病型[1-3]。IBV為正鏈單股RNA，全長約為17 kb。病毒囊膜有花冠狀排列的纖突，長約20 nm，病毒粒子略呈球形，直徑約為120 nm。IBV主要含有3種特異性結(jié)構(gòu)蛋白：表面纖突糖蛋白（S）、整合在雙層膜中的膜蛋白（M）和與RNA相結(jié)合的核衣殼蛋白（N）[4]。IBV基因組很容易發(fā)生變異，導(dǎo)致病毒的基因型、血清型、致病性、免疫原性等易發(fā)生變化，給本病的預(yù)防、診斷和控制帶來很大困難。目前，檢測IBV的分子生物學(xué)方法有RT-PCR、核酸探針、實時熒光定量PCR和RT-LAMP技術(shù)等[5-8]。為了能夠準(zhǔn)確、快速地診斷該病，提高分子生物學(xué)方法檢測IBV的敏感性，本試驗建立了RT-LAMP診斷方法，以為雞傳染性支氣管炎的臨床診斷和病原學(xué)調(diào)查提供技術(shù)儲備。

1 材料與方法

1.1 病毒及病料 IBV、禽流感病毒（AIV）、傳染性囊病病毒（IBDV）、馬立克病病毒（MDV）及新城疫病毒（NDV）和6份傳染性支氣管炎病毒病臨床疑似病料均由貴州省動物疫病研究室保存。

1.2 主要試劑 Thermopol Buffer、Bst DNA聚合酶，購自北京紐英倫（NEB）生物技術(shù)有限公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（200 U/μL），購自上海麗臣生物科技有限公司；RNAsimple Total RNA Kit總RNA提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成 參照GenBank中登錄的IBV N基因序列（NC001451），應(yīng)用在線Primer Explorer 3.0軟件設(shè)計了4條引物，包括兩條外引物F3/B3，兩條內(nèi)引物FIP/BIP。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

IBV-F3：CTACGATTCTCGGATGGC；

IBV-B3：TGCACGAGCAATAAGGTC；

IBV-FIP：TGTTGATCTTCCACTCCTACCACTTT TCCTGATGGTAATTTCCGTTG；

IBV-BIP：CAGCTTCATCAGCAGCAGCTTTTTA TCTCCAGAATCACTTCTACG。

1.4 病毒與病料RNA提取 參照RNAsimple Total RNA Kit總RNA提取試劑盒說明書，提取IBV、AIV、IBDV、MDV、NDV和6份臨床疑似IB病料的RNA。

1.5 RT-LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化 病毒RNA的反轉(zhuǎn)錄和LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化參照文獻[9]進行，采用25 μL反應(yīng)體系，分別對內(nèi)、外引物濃度、Bst DNA聚合酶、dNTP、Mg2+、反應(yīng)溫度及反應(yīng)時間等進行優(yōu)化，以確定LAMP最佳反應(yīng)體系。

1.6 特異性試驗 將NDV、AIV、MDV、IBDV進行RT-LAMP檢測，檢驗其特異性。

1.7 敏感性試驗 以IBV RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，用TU-1810測定其純度和濃度，10倍遞進稀釋，進行RT-LAMP，測定該方法的敏感性。同時用建立的RT-LAMP和常規(guī)RT-PCR進行檢測，RT-PCR采用LAMP外引物進行擴增，比較RTLAMP與常規(guī)RT-PCR檢測的靈敏度。

1.8 臨床樣本檢測 采用RT-LAMP和RT-PCR方法分別對6份臨床病料進行檢測，以比較這兩種方法的檢出符合率。

1.9 RT-LAMP反應(yīng)結(jié)果的可視化判定 RT-LAMP反應(yīng)完成后，擴增產(chǎn)物7 500 r/min離心5 min，然后將離心管置于光亮處觀察有無白色沉淀生成，觀察可視化結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化結(jié)果 通過對內(nèi)、外引物濃度、Bst DNA聚合酶、dNTP、Mg2+等進行優(yōu)化試驗，確定最佳內(nèi)引物與外引物的濃度比為40 μmol/L:5 μmol/L（圖 1），Bst DNA 聚合酶（8 U/μL)1.0 μL（圖 2），dNTP（10 mmol/L）3.0 μL（圖 3），鎂離子濃度為25 mmol/L 3.0 μL（圖4）。

確定的最佳反應(yīng)體系為：FIP&BIP（20 μmoL/L）2.0 μL，F(xiàn)3&B3（5 μmoL/L）1.0 μL，Bst DNA 聚合酶（8 U/μL)1.0 μL，dNTP（10 mmoL/L）3.0 μL，MgCl2（25 mmoL/L）3.0 μL，最后加滅菌去離子水補足25 μL。

2.2 LAMP反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間的優(yōu)化結(jié)果 通過對LAMP反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間進行優(yōu)化試驗，確定最佳反應(yīng)溫度為62℃（圖5），最佳反應(yīng)時間為 60 min（圖 6）。

2.3 特異性試驗 以優(yōu)化的RT-LAMP方法對IBV、AIV、IBDV、MDV、NDV的cDNA進行擴增，結(jié)果只有IBV出現(xiàn)了特征性梯狀條帶，而其他模板未見擴增條帶（圖7）。

2.4 敏感性試驗 建立的RT-LAMP方法最低檢測到10-6稀釋模板，即為0.19 pg cDNA模板（圖8）。而常規(guī)RT-PCR方法能檢測到cDNA的最低稀釋度10-3（圖9），結(jié)果顯示，本試驗建立的IBV RT-LAMP敏感性比常規(guī)RT-PCR高1 000倍。

2.5 RT-LAMP方法對臨床樣本的檢測 應(yīng)用建立的RT-LAMP方法對6份臨床病料進行檢測，結(jié)果（見圖10），IBV檢出率為100%（6/6），與RT-PCR的檢出結(jié)果相符，二者的檢出符合率為100%。

2.6 RT-LAMP反應(yīng)結(jié)果的可視化判定 LAMP反應(yīng)完成后，產(chǎn)物7 500 r/min離心5 min，然后將離心管置于光亮處觀察有無白色沉淀生成。其結(jié)果如圖11所示。

圖11中，1號管為陽性組，肉眼可看到明顯的白色沉淀，2號管為陰性組，未見到沉淀。因而可以直接觀察反應(yīng)是否發(fā)生。

3 討論

LAMP技術(shù)反應(yīng)特異性主要依靠外引物(F3、B3)和內(nèi)引物(FIP、BIP)的擴增來實現(xiàn)[10]。本試驗根據(jù)IBV結(jié)構(gòu)蛋白N基因保守序列，采用在線Primer Explorer 3.0軟件設(shè)計了4條引物，所設(shè)計的引物能特異識別目標(biāo)序列的6個區(qū)域，特異性擴增IBV的靶基因，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物為大小不同的梯狀條帶，而AIV、IBDV、MDV、NDV未見擴增條帶，表明該方法的特異性強。本試驗建立的RT-LAMP方法敏感性比常規(guī)RT-PCR高1 000倍，兩種方法對臨床樣本檢測的符合率為100%，表明建立的方法敏感性高，可用于臨床上IBV的分子生物學(xué)檢測。

LAMP方法的建立可在復(fù)合引物F1C和F2間及B1C和B2間設(shè)計環(huán)引物F-loop和B-loop，目的是提高反應(yīng)效率，減少試驗耗時。本試驗為減少加樣次數(shù)，簡化試驗操作過程，在不加環(huán)引物的反應(yīng)體系中，從15 min開始有條帶，并且逐漸變亮，可在60 min內(nèi)完成全部反應(yīng)，為IBV感染的快速檢測提供新方法。

LAMP擴增產(chǎn)物的檢測主要有3種，凝膠電泳檢測，濁度檢測和熒光顯色。通過凝膠電泳檢測可見特異性的梯狀條帶；反應(yīng)完成后可直接通過觀察擴增副產(chǎn)物白色焦磷酸鎂沉淀混合液判定反應(yīng)結(jié)果；也可在反應(yīng)體系中加入鈣黃綠素(Calcein)和Mn2+、羥基萘芬藍（HNB）、Picogreen、溴化乙錠（EB），或向產(chǎn)物管中加入SYBR Green I、Gene Finder染料顯色[11-12]。本試驗在反應(yīng)結(jié)束后，在LAMP反應(yīng)不開蓋的前提下，直接離心，目視檢查LAMP的副產(chǎn)物焦磷酸鎂懸濁液形成白色沉淀，陽性反應(yīng)管白色沉淀集于管底，陰性反應(yīng)管無此現(xiàn)象。由此可見LAMP反應(yīng)結(jié)果易于判定，適合于基層獸醫(yī)站和養(yǎng)殖場進行快速檢測。

[1]劉勝旺.我國雞傳染性支氣管炎流行現(xiàn)狀及原因分析[J].中國家禽，2010，32（16）：5-9．

[2]Yu L，Jiang Y，Low S，et a1.Characterization of three infectious bronchitis virus isolates from China associated with proventriculus in vaccinated chickens[J].Avian Dis，2001A5（2）：416-424.

[3]sjaak W J，Cook J K，He，et al.Infectious bronchitis virus variants：a review of the history，current situion and control measures[J].Avian Pathol，2011，40（3）：223-35．

[4]殷震，劉景華.動物病毒學(xué)[M].2版.北京：科學(xué)出版社，1997．

[5]劉金朋，商艷紅，陳紅英，等.雞傳染性支氣管炎病毒RTPCR快速檢測方法的建立[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2011，27（03）：342-346．

[6]莫勝蘭，劉惠莉，陸承平，等.核酸探針檢測雞傳染性支氣管炎病毒的建立及應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2007，27（2）：168-171.

[7]磨美蘭，陳秋英，侯金蓮，等.雞傳染性支氣管炎病毒realtime PCR 檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2011，41（02）：193-198．

[8]羅思思，謝芝勛，龐耀珊，等.雞傳染性支氣管炎病毒RTLAMP可視化檢測方法的建立[J].中國農(nóng)學(xué)通報2012，28（20）：83-87．

[9]鮮思美，韋洪才，尹強軍，等.鵝副粘病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴增快速檢測方法的建立及應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報，2012，11：150-154.

[10]高德臣.環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)在病原檢測中的應(yīng)用[J].中國畜牧獸醫(yī)，2012，39（2）：219-221．

[11]張琳，馬利，丁雅苓，等.基于熒光顯色的IBV LAMP檢測方法研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2012，40（10）：38-44.

[12]許鄒亮，南文龍，周潔，等.布魯氏菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）可視化檢測方法的建立[J].中國動物檢疫，2011，28（8）：37-40．